骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用.pdf

1、一、大鼠及小鼠輕癥和重癥急性胰腺炎模型的建立 目的：制作雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠和小鼠輕癥急性胰腺炎(MAP)模型及L-精氨酸誘導(dǎo)的大鼠和小鼠重癥急性胰腺炎(SAP)模型，并對(duì)兩個(gè)模型進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察。 方法：皮下注射雨蛙肽制備大鼠和小鼠MAP模型；腹腔注射L-精氨酸制備大鼠和小鼠SAP模型。光鏡下觀察胰腺、肝臟、腸道和肺臟組織學(xué)變化，采用酶法測(cè)定血清淀粉酶的變化。 結(jié)果：在采集的受體7個(gè)組織器官中，均有239bp處的Sry

2、基因，兩組的陽(yáng)性率均為100％。 結(jié)論：MSC在生理和病理情況下，可以遷移并分布于小鼠的胰腺及其他主要組織器官中。 三、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺生理更新和病理再生中的作用。 方法：將60只體重180～220gSprague-Dawley(SD)大鼠隨機(jī)分為5組，每組12只。A組為正常陰性對(duì)照組，不作任何處理；B組為自體骨髓回輸對(duì)照組，C組為雨蛙肽致輕癥胰腺炎

3、(MAP)模型組，D組為L(zhǎng)-精氨酸致重癥胰腺炎(SAP)模型組，E組為粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)預(yù)處理組(SAP+GSF)：在造模前3d,scG-CSF40μg/(kg·d)，共3d，其余處理同D組。造模前3d用核染料Hoechst33258標(biāo)記自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，并回輸?shù)阶泽w骨髓腔。于骨髓干細(xì)胞回輸后的2wk和8wk，分批處死大鼠，采集胰腺，立即進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡下直接觀察胰腺組織中是否有呈現(xiàn)黃綠色熒光的細(xì)胞，選擇

4、有上述有黃綠色熒光的冰凍切片進(jìn)行免疫熒光染色，觀察有無(wú)Cytokeratin19、胰島素和胰高血糖素染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。 結(jié)果：A組的胰腺冰凍切片未見有黃綠色熒光。造模后2wk，B、C、E和D組存活大鼠可見標(biāo)記的MSC出現(xiàn)在正常胰腺組織和損傷胰腺組織中，在正常胰腺組織中偶見，而在損傷胰腺組織中多見，尤以GSF預(yù)處理組最多見，C、D、E組一直持續(xù)到8wk仍可見到黃綠色熒光。A和D組死亡大鼠未見Cytokeratin19、胰島素和胰高

5、血糖素染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。造模后2wk，B、C、E和D組存活大鼠摻入損傷胰腺中的MSC均有分化為Cytokeratin19染色陽(yáng)性的細(xì)胞，未見胰島素和胰高血糖素染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞。造模后8wk，胰島素和胰高血糖素染色呈陽(yáng)性的細(xì)胞在C、D組偶見，E組散見。 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在自然情況下，參與胰腺的生理更新和損傷修復(fù)。生理情況下，胰腺更新少、慢，主要由胰腺干細(xì)胞補(bǔ)充，病理?yè)p傷時(shí)，自體骨髓干細(xì)胞可隨血液循環(huán)到達(dá)損傷的胰腺，轉(zhuǎn)化為胰腺

6、干細(xì)胞，最終進(jìn)入增殖和分化程序，成為成熟的胰腺細(xì)胞，參與胰腺病理修復(fù)。 四、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在早期重癥急性胰腺炎并發(fā)多臟器功能障礙綜合征中的作用目的：探討骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在早期重癥急性胰腺炎并發(fā)多臟器功能障礙綜合征中的作用。 方法：將50只體重180～220gSprague-Dawley(SD)雌性大鼠隨機(jī)分為5組，每組10只。A組為正常對(duì)照組，不作任何處理，B組為L(zhǎng)-精氨酸致早期重癥胰腺炎(ESAP)模型組，C組為自體

7、骨髓回輸對(duì)照組，造模后1d用核染料Hoechst33258標(biāo)記自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，并回輸?shù)阶泽w骨髓腔，其余處理同B組。D組為異體骨髓移植組，在造模前3d通過尾靜脈移植雄性MSC，E組為粒細(xì)胞集落因子(G-CSF)預(yù)處理組(ESAP+GSF)：造模前3d用核染料Hoechst33258標(biāo)記自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，并回輸?shù)阶泽w骨髓腔，在造模前3d，scG-CSF40μg/(kg·d)，共3d，其余處理同B組。復(fù)制SAP模

8、型后72h處死大鼠，解剖，觀察大體組織形態(tài)，包括胰腺及肝臟、腸道，一部分組織立即進(jìn)行冰凍切片，熒光顯微鏡下觀察組織中有否熒光標(biāo)記的MSC出現(xiàn)。選擇有熒光的切片，進(jìn)行相應(yīng)組織的免疫熒光染色。對(duì)胰腺、肝臟切片進(jìn)行CK19免疫熒光染色，以觀察其是否分化為胰腺干細(xì)胞和肝臟干細(xì)胞。對(duì)腸道切片進(jìn)行PanCytokeratin免疫熒光染色，以觀察MSC是否分化為腸上皮細(xì)胞；另一部分組織常規(guī)石蠟包埋，切片后HE染色后，光鏡下觀察胰腺、肝臟、腸道組織學(xué)改

9、變。記錄造模后72h內(nèi)的死亡率。 結(jié)果：①72h死亡率，A組為0，B組和C組為40％，E組和D組為10％。 ②病理?yè)p傷情況：大體觀察：A組為正常的組織結(jié)構(gòu)狀態(tài)。B、C組在造模后72h胰腺壞死，胰周脂肪皂化，出現(xiàn)大量血性腹水，在死亡的大鼠中，可見肝臟、腸、肺等多臟器受累、壞死。D、E組大鼠肉眼可見腹水量明顯減少，胰腺輕度水腫，無(wú)出血壞死灶。光鏡觀察：A組胰腺組織結(jié)構(gòu)清晰，腺泡小葉完整，間質(zhì)無(wú)滲出，B組、C組在造模后72h，

10、胰腺大片凝固性壞死，結(jié)構(gòu)模糊，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，D、E組胰腺腺體小葉結(jié)構(gòu)基本清晰，出血壞死減輕，間質(zhì)中炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較輕。A組肝臟小葉結(jié)構(gòu)正常，B、C組肝細(xì)胞變性，灶狀壞死，D、E組肝細(xì)胞輕度腫脹，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；A組大鼠腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)清楚，B、C組大鼠腸黏膜腺體紊亂，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，D、E組腸黏膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減輕。③熒光染色情況：A、B組的胰腺、肝臟、腸道冰凍切片未見有黃綠色熒光，C組切片中偶見黃綠色熒光，但胰腺、肝臟切片未見CK19免

11、疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞，腸道切片未見PanCytokeratin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞；D組和E組切片黃綠色熒光多見，且胰腺、肝臟切片中可見CK19免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞，腸道切片中可見PanCytokeratin免疫熒光染色陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞參與早期重癥急性胰腺炎并發(fā)肝臟、腸損傷時(shí)的病理修復(fù)，并可分化為肝卵圓細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞，異體MSC移植和自體MSC動(dòng)員對(duì)早期重癥急性胰腺炎并發(fā)多臟器功能障礙綜合征有保護(hù)作用。

12、 總結(jié)：雨蛙素誘導(dǎo)的大鼠及小鼠MAP模型和L-精氨酸誘導(dǎo)的大鼠及SAP模型輕重不同，簡(jiǎn)便、可靠、重復(fù)性及可比性好，適合AP的發(fā)病機(jī)制和治療學(xué)的研究。異體移植的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在生理和病理(輕癥急性胰腺炎)情況下，可以遷移并分布于小鼠的胰腺及其他主要組織器官中。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在自然情況下，可以參與胰腺的生理更新和損傷修復(fù)。生理情況下，胰腺更新少、慢，主要由胰腺干細(xì)胞補(bǔ)充，病理?yè)p傷時(shí)，自體骨髓干細(xì)胞可隨血液循環(huán)到達(dá)損傷的胰腺，轉(zhuǎn)化為胰腺干