骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在胰腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、目的：
　　 1.建立DMBA誘導(dǎo)的胰腺癌模型，并探討其遺傳學(xué)特征；2.探討B(tài)MSCs在胰腺癌發(fā)生中的作用；3.探討B(tài)MSCs在胰腺癌發(fā)展中的作用。
　　 研究方法
　　 1.大鼠胰腺DMBA包埋3月后收集瘤樣包塊，評(píng)估組織病理學(xué)特征。運(yùn)用PCR與DNA測(cè)序技術(shù)檢測(cè)病變組織K-ras與p16突變模式。
　　 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠GFP標(biāo)記的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（GFP-BMSCs）表面標(biāo)志，在成骨與成脂培養(yǎng)

2、基中培養(yǎng)誘導(dǎo)GFP-BMSCs向骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化。建立DMBA誘導(dǎo)的胰腺癌－GFP-BMSCs尾靜脈注射模型，應(yīng)用GFP免疫組化與免疫熒光激光共聚焦成像技術(shù)分析BMSCs在胰腺癌中的遷移與分布；運(yùn)用導(dǎo)管上皮標(biāo)志CK-19、胰腺星狀細(xì)胞分子標(biāo)志α-SMA與Desmin免疫組化與免疫熒光雙染激光共聚焦成像技術(shù)分析胰腺癌組織中BMSCs的表型，并統(tǒng)計(jì)GFP+/CK-19+、GFP＋/α-SMA＋、GFP＋/Desmin＋亞群所占比例。

3、r>　　 3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（HMSCs）表面標(biāo)志，在成骨與成脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)誘導(dǎo)HMSCs向骨細(xì)胞與脂肪細(xì)胞分化。體外試驗(yàn)：利用HMSCs與胰腺癌細(xì)胞直接或間接共培養(yǎng)計(jì)數(shù)培養(yǎng)后的腫瘤細(xì)胞分析HMSCS對(duì)胰腺癌細(xì)胞增殖的影響；應(yīng)用過氧化氫（H2O2）誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，Annexin V/PI法流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HMSCs對(duì)胰腺癌細(xì)胞凋亡的影響。利用Transwell小室細(xì)胞遷移與侵襲試驗(yàn)分析HMSCs對(duì)胰腺癌細(xì)胞遷移與

4、侵襲行為的影響。體內(nèi)試驗(yàn)：建立胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型，接種胰腺癌細(xì)胞時(shí)共注射HMSCs，動(dòng)態(tài)觀察其對(duì)腫瘤生長的影響；建立胰腺癌裸鼠胰腺原位移植瘤模型，接種胰腺癌細(xì)胞時(shí)共注射HMSCs，觀察脾、肝臟、腸系膜、腹膜后等部位的轉(zhuǎn)移情況。收集上述模型標(biāo)本，HE染色分析組織病理學(xué)特征；Masson’s trichrome 染色分析HMSCs對(duì)腫瘤間質(zhì)的影響；Ki-67免疫組化分析組織水平的增殖指數(shù)；TUNEL染色分析組織水平的凋亡指數(shù)。

5、　　 結(jié)果：
　　 1.組織病理學(xué)診斷如下：反應(yīng)性增生4例(10.26％)、胰腺上皮內(nèi)瘤變26例(66.67％)、胰腺癌9例(23.07％)。K-ras基因在85.71％ (30/35)的樣本中擴(kuò)增及測(cè)序成功，所有樣本未見外顯子1與外顯子2點(diǎn)突變。P16基因在所有樣本中擴(kuò)增及測(cè)序成功，其總體突變率為42.86％ (15/35)。突變方式均為點(diǎn)突變，未見同源性缺失。其中30.77％ (8/26)胰腺上皮內(nèi)瘤變和77.78％ (7

6、/9)胰腺癌中可檢測(cè)出p16突變，兩者突變率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。PanIN-1、PanIN-2及PanIN-3病變中p16突變率逐漸升高，分別為20.00％ (1/5)、28.57％ (2/7)、35.71％ (5/14)，三者之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。P16點(diǎn)突變形式包括顛換突變和轉(zhuǎn)換突變。大多數(shù)樣本點(diǎn)突變位點(diǎn)包含2個(gè)或2個(gè)以上的密碼子。
　　 2.試驗(yàn)組胰腺癌實(shí)質(zhì)（癌巢）與間質(zhì)（致密結(jié)締組織）中均見GFP表達(dá)，而對(duì)

7、照組中則無表達(dá)。GFP+/CK-19+亞群占全部GFP+細(xì)胞比例為10.8±2.6％，幾乎全部分布于腫瘤實(shí)質(zhì)內(nèi)。GFP＋/α-SMA＋、GFP＋/Desmin＋亞群比例少于5％，幾乎全部分布于腫瘤間質(zhì)。
　　 3.Panc-1對(duì)照組、條件培養(yǎng)基組、共培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)目依次為（5.38±0.69）×104、（7.83±0.65）×104、（10.62±0.47）×104，其中條件培養(yǎng)基組、共培養(yǎng)組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P<0.05；P<0.01）。Bxpc-3對(duì)照組、條件培養(yǎng)基組、共培養(yǎng)組的細(xì)胞數(shù)目依次為（15.43±0.61）×104、（24.57±1.33）×104、（38.48±1.01）×104，其中條件培養(yǎng)基組、共培養(yǎng)組與對(duì)照組的細(xì)胞數(shù)目差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05；P<0.01）。遷移試驗(yàn)：Panc-1、Bxpc-3條件培養(yǎng)基組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組（225.6±35.0 vs.140.6±18.5，P<0.001；101.9±1

9、5.1 vs.43.6±11.5，P<0.001）。侵襲試驗(yàn)：Panc-1、Bxpc-3條件培養(yǎng)基組穿膜細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組（101.8±16.8 vs.45.8±13.1，P<0.01；114.4±21.8 vs.49.0±11.34，P<0.01）。
　　 共注射組腫瘤體積顯著大于對(duì)照組。腫瘤生長曲線示共注射組腫瘤生長速度為對(duì)照組的5倍以上（P<0.0001）。共注射組與對(duì)照組的腫瘤質(zhì)量的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（0.325±0.

10、091 vs.0.063±0.017 g，P<0.05）。移植瘤HE染色可見共注射組中出現(xiàn)散在的致密結(jié)締組織，交錯(cuò)于腫瘤細(xì)胞之間。Masson’s trichrome染色可見共注射組中存在大量膠原纖維，與HE染色中致密結(jié)締組織相對(duì)應(yīng)。共注射組膠原纖維面積比顯著高于對(duì)照組（27.1±4.3 vs.2.7±0.8％，P<0.001）。Ki-67免疫組化示共注射組增值指數(shù)顯著高于對(duì)照組（68.6±8.1 vs.30.1±6.4％，P<0.01

11、）。TUNEL染色示共注射組凋亡指數(shù)顯著低于對(duì)照組（10.0±2.5vs.2.8±0.8％，P<0.01）。共注射組在脾、肝臟、腸系膜、腹膜后的轉(zhuǎn)移率都高于對(duì)照組。兩者在脾及肝臟的轉(zhuǎn)移率之間的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（25.0 vs.75.0％，P<0.05；25.0 vs.83.3％，P<0.05）。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　 1.我們成功建立了DMBA誘導(dǎo)的胰腺癌模型。該模型中未見K-ras點(diǎn)突變（外顯子1與外顯子2），與人

12、胰腺癌突變模式不同。而該模型中p16突變是腫瘤發(fā)展過程中的常見現(xiàn)象，與人胰腺癌突變模式相似。
　　 2.BMSCs遷移至DMBA誘導(dǎo)的胰腺癌實(shí)質(zhì)與間質(zhì)中，參與了實(shí)質(zhì)與間質(zhì)的發(fā)生。BMSCs通過轉(zhuǎn)分化途徑參與胰腺癌的發(fā)生，很可能成為胰腺癌潛在的細(xì)胞來源。
　　 3.BMSCs通過促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲能力、間質(zhì)形成以及抑制凋亡等機(jī)制促進(jìn)胰腺癌的生長與轉(zhuǎn)移。BMSCs在胰腺癌發(fā)展中發(fā)揮促癌作用，應(yīng)用BMSCs作為載體