BMP2和VEGF165在誘導大鼠骨髓間充質干細胞成骨再生中的作用.pdf

1、背景
　　 因創(chuàng)傷、腫瘤及關節(jié)翻修術等原因所致的骨缺損是當前骨外科常見的問題之一。自體骨、異體骨和人工骨是目前骨缺損的主要修復材料來源。自體骨移植因面臨二次手術、來源不足、傷口部感染等因素，其臨床應用受到了限制;同時，異體骨移植也因存在免疫排異反應、疾病傳播及倫理道德等限制，無法在臨床廣泛應用。構建活性人工骨修復材料為骨缺損的修復提供了方向，而種子細胞和生物活性因子則是構成活性人工骨修復材料的重要要素。
　　 活性人工骨

2、修復材料研究對于種子細胞的要求主要為:①適合臨床應用需要，即來源廣泛、取材簡便、創(chuàng)傷小;②誘導后的細胞移植入體內后無免疫排斥反應;③具有多向分化的潛能，在體外擴增達到所要求的細胞數(shù)量時保持其成骨表型，在體內外誘導因子的作用下可以擴大增殖。眾所周知，干細胞具有多向分化性，控制體外培養(yǎng)條件可使干細胞向成骨細胞、成軟骨細胞等方向分化。干細胞包括組織干細胞和胚胎干細胞，胚胎干細胞的使用面臨著很多倫理學和安全性的問題，而且體外培養(yǎng)條件要求十分嚴格

3、，其應用存在很大的局限性。相比較而言，組織干細胞可能是近期內能夠應用于骨組織工程尤其是臨床應用的最佳種子細胞來源，目前比較明確的能夠向成骨細胞轉化的組織干細胞主要是骨髓間充質干細胞，骨髓間充質干細胞具有多分化潛能，可分化成纖維細胞、成骨細胞等，增值能力強，來源廣泛，取材方便，供區(qū)損傷小，因而倍受人們的關注。
　　 生物活性因子在促進骨修復過程中發(fā)揮極其重要的作用，骨缺損愈合是骨組織完全性再生的過程，其組織學過程伴隨著復雜的分子生

4、物學調節(jié)機制，大量活性因子在不同的骨愈合階段發(fā)揮不同的作用，而促進新骨形成和局部血運重建的活性因子顯得尤為重要。影響新骨形成研究較為深入的生物因子為骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone Morphogenetic Proteins，BMPs），BMPs對骨原細胞的分化起決定性作用，是促進成骨的主要因子。BMPs家族成員較多，至今已有40多種BMP蛋白被成功地分離。其中BMP2是轉化生長因子β(TGF-β)超家族中的多功能細胞因子，可在骨損傷局部及異

5、位促進細胞增殖，提高其堿性磷酸酶活性，也是唯一能夠單獨在異位誘導成骨形成的信號分子，這使其在骨關節(jié)疾病特別是骨折、骨缺損的臨床治療中具有極大的潛在應用價值。研究表明BMP2是BMP家族成員中骨誘導作用最強的因子，大量實驗也證實了將BMP2直接或通過載體局部應用可促進骨形成。同時，骨組織工程中骨血管化也是一個關鍵環(huán)節(jié)，其作用貫穿于整個骨再生修復過程，充足的血供不僅有利于種子細胞的存活、增殖和分化，同時還可加速新骨的形成，從而加快骨缺損的修

6、復。促血管化的生物因子有數(shù)十種，Vascular Endothelial Growth Factor(VEGF)是目前公認為作用最強，特異性最高的一種的促血管生成因子，VEGF在血管生成中具有直接和間接的調控作用，一方面可以刺激EC增殖、遷徙，另一方面可以增加血管的通透性，使許多血漿蛋白滲出血管外，這對改造局部的細胞外基質以適應血管生成具有重要作用。VEGF還可以刺激成骨細胞的分化增殖，加速骨的形成和重塑。其中VEGF165是一種分泌性

7、生長因子，廣泛地存在于多種組織細胞中，不僅具有促進血管生成活性，而且其表達產物是可溶性的，表達后可從細胞中分泌出來，擴散性強，易到達靶細胞，能很好的發(fā)揮生物學活性。
　　 自從發(fā)現(xiàn)BMP2和VEGF165都參與骨形成，單純運用生物活性因子于局部發(fā)揮作用面臨著體內半哀期短、容易被體液沖走或稀釋的難題，難保持局部有效治療濃度?；蚣夹g的發(fā)展為我們提供了有效的手段，基因治療是維持骨缺損局部生物活性因子有效治療濃度最具有希望的一種方法。

8、目前用作基因治療的載體主要分為非病毒載體及病毒載體，病毒載體中運用較多的為慢病毒載體，慢病毒(Lentivirus)是一類免疫缺陷性病毒，是由這些病毒引起慢性感染而得名。慢病毒載體也是一類逆轉錄病毒載體，它既能夠感染分裂細胞，也能夠感染非分裂細胞，由于慢病毒載體能夠感染大多數(shù)非分裂細胞，以及具有高效地整合和穩(wěn)定地表達目的基因于靶細胞的能力，所以已被廣泛應用于各種基因治療實驗研究。一些科學家推測，VEGF165結合BMP2相對于單個基因將

9、出現(xiàn)更有效的骨再生效應，這個推測值得信任嗎？這將涉及到VEGF165結合BMP2雙基因共轉染干細胞遠期是否能運用于骨缺損修復，因此，評估VEGF165結合BMP2基因在骨再生過程中的作用具有重要意義。
　　 目的：
　　 1、通過慢病毒載體介導VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓間質干細胞，掌握慢病毒轉染技術，以便應用于以后其他研究。
　　 2、探討體外VEGF165和BMP2基因共感染大鼠骨髓間質干細胞在

10、骨再生過程中的作用。
　　 材料和方法
　　 1、采用分子生物學的方法設計、合成引物，使用PCR的方法擴增VEGF165和BMP2基因，利用基因工程技術構建BMP2慢病毒表達載體和BMP2/VEGF165雙基因慢病毒表達載體，限制性核酸內切酶酶切鑒定篩選陽性克隆，菌落PCR鑒定篩選慢病毒表達載體，測序并與Genebank比較。
　　 2、在脂質體Lipofectamine2000介導下將構建成功BMP2和BMP2

11、/VEGF165慢病毒表達載體分別與輔助質粒共轉染人胚腎細胞系(293T)包裝生產慢病毒，測定病毒滴度。
　　 3、復蘇P3的SD MSC（購自賽業(yè)生物公司），經過一次傳代后，待細胞狀態(tài)較好時可用于轉染，即使用P5的SD MSC進行轉染。慢病毒1（攜帶BMP2、VEGF165、EGFP和neo）和慢病毒2(攜帶BMP2、EGFP和neo)分別轉染SD MSC，轉導48小時后于熒光顯微鏡下觀察轉導效果，待兩株細胞長至80％融合度時

12、，用0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml三個濃度的G418進行轉染細胞株的純化篩選。
　　 4、運用Trizol方法進行SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細胞RNA抽提，進行cDNA鏈的合成。設計VEGF165、BMP2和GAPDH的引物序列去探測mRNA的表達，轉導后第5天的SDMSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細

13、胞作為實驗組，非轉導組作為對照組，Q-PCR法檢測各組細胞BMP2、VEGF165 mRNA表達。
　　 5、SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細胞感染后孵化48小時，感染組作為實驗組，非感染組作為對照組，三組細胞分離出來的蛋白質被轉移到PVDF轉移膜以及膜的封閉，將適當濃度的BMP2和VEGF165一抗和二抗加入到PVDF膜上，將ECL液滴加于PVDF膜表面，置于Fiuorc

14、hem HD2凝膠成像分析系統(tǒng)中，觀察、拍照。
　　 6、SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP和SD MSC/BMP2-EGFP兩種細胞作為實驗組，非感染組作為對照組，每組的細胞進行了3d、7d和14d成骨分化分析。細胞堿性磷酸酶活性檢測是由堿性磷酸酶(ALP)測定試劑盒完成。另一方面，三組細胞在成骨分化誘導14天后進行茜素紅染色和堿性磷酸酶染色，倒置顯微鏡拍照;
　　 結果
　　 1、成功了構建BM

15、P2慢病毒表達載體和BMP2/VEGF165雙基因慢病毒表達載體，菌落PCR鑒定及測序與Genebank比較，證明構建的慢病毒表達載體正確。
　　 2、BMP2和BMP2/VEGF165慢病毒表達載體分別轉染人胚腎細胞系(293T)后熒光激發(fā)可見大量綠色熒光，收集、濃縮病毒后測定其滴度分別為7.45×107TU/ml和6.45×107TU/ml。
　　 3、慢病毒1（攜帶BMP2、VEGF165、EGFP和neo）和慢病

16、毒2（攜帶BMP2、EGFP和neo）分別轉染SD MSC，轉導48小時后于熒光顯微鏡下觀察， SDMSC/BMP2-EGFP轉染率約為85％，SD MSC/BMP2-VEGF165-EGFP轉染率約為80％，且熒光強。
　　 4、對照組沒觀察到BMP2和VEGF165基因的mRNA表達，在SD MSC/BMP2組未測量到VEGF165mRNA表達，在SD MSC/BMP2+VEGF組可以測量到VEGF165mRNA表達;SD

17、MSC/BMP2和SD MSC/BMP2+VEGF兩種細胞都可以測量到BMP2基因的mRNA表達，兩組BMP2的表達沒有顯著性差異(P＞0.05).
　　 5、免疫印跡分析表明，感染Lv-BMP2-VEGF165和Lv-BMP2骨髓間充質干細胞分泌大量的BMP2，那些非轉染的骨髓間充質干細胞BMP2分泌量極低。另一方面，所有的細胞，包括轉染和或非轉染的骨髓間充質干細胞均分泌大量的VEGF165。
　　 6、成骨分化誘導第

18、14天，三組細胞中陽性染色面積最大的是BMP2組，BMP2+VEGF165組的陽性染色面積大于對照組，但小于BMP2組，對照組堿性磷酸酶和茜素紅染色均為陰性。在三組細胞中，誘導分化后第14天的堿性磷酸酶活性跟第3天和7天差別有顯著性差別(P＜0.01);在誘導分化后第3、7、14天BMP2組ALP活性均顯著高于BMP2+VEGF165組(P＜0.01)。
　　 結論
　　 1、VEGF165表達抑制BMP2轉染的骨髓間質