BMP-7在雷奈酸鍶促進骨髓間充質(zhì)干細胞成骨分化過程中的作用.pdf

1、[研究背景和目的]:
　　 骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)主要是由于骨吸收與骨形成之間的平衡被打破，骨吸收量大于骨形成量，從而引起骨量減少的一種疾病。一般認為，破骨細胞活性增強，導(dǎo)致骨吸收增加，是形成骨質(zhì)疏松的重要原因。
　　 骨髓間充質(zhì)干細胞(Bonemarrowstromalstemcells，BMSCs)在特定的誘導(dǎo)條件下，可以向不同的細胞方向分化，包括成骨細胞、神經(jīng)細胞、心肌細胞、軟骨細胞、脂肪細胞等。鑒于

2、BMSCs具有定向成骨分化的潛能，骨髓間充質(zhì)干細胞也成為人工骨材料的主要來源之一。BMSCs的研究也逐漸引起人們的關(guān)注。
　　 BMSCs成骨轉(zhuǎn)化過程中有多種成骨標(biāo)志物，其中堿性磷酸酶(ALP)活性的提高是成骨分化的重要標(biāo)志之一，另外ALP也參與成骨細胞的結(jié)節(jié)鈣化。骨形態(tài)蛋白（Bonemorphogeneticprotein，BMP）是多功能生長因子，屬于轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)超家族，是一組具有類似結(jié)構(gòu)的保守的功能蛋白組

3、成，能夠在體內(nèi)誘導(dǎo)骨和軟骨形成，并在肢體生長、軟骨內(nèi)骨化、骨折早期軟骨修復(fù)及骨骼的胚胎發(fā)育和再生修復(fù)等方面起重要作用。已知的已經(jīng)被克隆出的BMPcDNA有17種，目前的研究表明能有效地促進BMSCs向成骨細胞分化，誘導(dǎo)骨的形成的BMP主要是BMP2/3/4/5/7。BMP-7是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的一員，主要在骨組織和腎組織中表達，特別在骨發(fā)育和骨折愈合過程中高表達。研究發(fā)現(xiàn)BMP-7在自體骨表面可以生成關(guān)節(jié)軟骨面，還可以在某些特定的環(huán)

4、境下修復(fù)軟骨、肌腱和韌帶。國內(nèi)外研究表明給予外源性BMP-7可促進BMSCs向成骨轉(zhuǎn)化。國外研究表明應(yīng)用BMP-7治療骨損傷的治愈率明顯高于對照組。因此BMP-7作為促進骨形成的重要骨形成蛋白因子，引起越來越多人的關(guān)注。
　　 Osterix(OSX)是最新由Nakashima等人發(fā)現(xiàn)的一種含鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，屬于Sp/XKLF家族，它是一個由428個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，研究表明OSX蛋白分布于細胞核中，其作用與組織的分化成熟

5、密切相關(guān)。在OSX基因剔除的小鼠胚胎中，膜性骨骼的致密間充質(zhì)和軟骨內(nèi)骨骼的骨膜及間充質(zhì)中，成骨細胞分化的各種標(biāo)志物的表達水平嚴重降低或者缺如，可見成骨細胞的分化被完全阻斷。OSX基因剔除細胞可表達軟骨細胞的特征性標(biāo)志物，因此OSX可能具有抑制骨/軟骨祖細胞向軟骨細胞分化的功能。
　　 雷奈酸鍶(Strontiumranelate，Sr)是新型的抗骨質(zhì)疏松藥物，具有促進骨形成，抑制骨吸收的作用，它能保護去卵巢大鼠的骨流失，并且可促

6、進成骨細胞ALP活性的表達。給予Sr治療能明顯促進成骨細胞轉(zhuǎn)錄因子水平的增高。此外越來越多的研究者關(guān)注分子水平上Sr促進骨形成的機制。本實驗通過觀察BMSCs成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中ALP、BMP-7、鈣結(jié)節(jié)、OSX基因表達，探討Sr促進骨形成的作用。通過添加BMP-7阻斷劑noggin觀察Sr促進骨形成過程中ALP、BMP-7、鈣結(jié)節(jié)、OSX基因表達的變化，探討Sr促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程BMP-7所起作用，為臨床上應(yīng)用Sr防治骨質(zhì)

7、疏松等疾病提供新穎的實驗依據(jù)。
　　 [實驗方法]:
　　 1、SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)
　　 本實驗擬采用步驟相對簡單的全骨髓貼壁法將BMSCs從骨髓中分離出來，并在體外進行培養(yǎng)和擴增，倒置顯微鏡下觀察其增殖和生長特性。以此建立一套穩(wěn)定有效、重復(fù)性好的BMSCs體外分離、培養(yǎng)和擴增的方法。并取生長良好的第3～4代BMSCs用做實驗。
　　 2、分別用細胞堿性磷酸酶標(biāo)法、茜素紅染色法、免疫印跡法(We

8、sternblotting)、逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測不同濃度Sr作用下ALP活性的表達、鈣結(jié)節(jié)的表達、BMP-7的表達水平及特異轉(zhuǎn)錄因子OSX基因的表達情況;相同濃度Sr作用不同時間作用下BMP-7及OSX基因的表達情況。
　　 3、加入BMP-7阻斷劑noggin預(yù)處理BMSCs2小時后再加入Sr處理培養(yǎng)細胞并用堿性磷酸酶標(biāo)法、茜素紅染色法、Westernblotting方法、RT-PCR方法檢測對照組及各實

9、驗組的ALP活性、鈣結(jié)節(jié)的表達、BMP-7及OSX基因的表達情況。
　　 4、統(tǒng)計學(xué)方法:計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)(x)±S表示，應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果可采用兩獨立樣本T檢驗和單因素方差分析(One-wayANOVA)方法，方差齊性用LSD法進行組間多重比較，方差不齊時用Dunnet-t檢驗。P＜0.05被定為有統(tǒng)計學(xué)差異。
　　 [實驗結(jié)果]:
　　 1.細胞學(xué)形態(tài)觀察
　　 細胞接

10、種后隨即在倒置顯微鏡下觀察，培養(yǎng)液中存在著很多大小不等的圓形細胞，其中造血細胞為主要成分。原代BMSCs接種24小時，僅見少量貼壁細胞，近似圓形或短梭形，48小時貼壁細胞逐漸增多，細胞漸變長。3天后更換培養(yǎng)液，除去絕大部分懸浮細胞，可見分散的BMSCs小集落，集落細胞呈放射狀生長。隨培養(yǎng)時間延長細胞集落增大，細胞形態(tài)為長梭形，9～10天細胞集落彼此融合，呈旋渦狀生長。
　　 2.不同濃度Sr對BMSCs成骨分化過程中ALP活性的

11、影響
　　 BMSC分別給予Sr濃度為0.1、1、3、5和7mmol/L，誘導(dǎo)分化細胞連續(xù)培養(yǎng)7天后檢測ALP活性，發(fā)現(xiàn)ALP活性增強，其中在0.1-3mmol/L濃度范圍內(nèi)，Sr呈濃度依賴性地增加ALP活性。濃度為3mmol/L是ALP活性表達最高。
　　 3.Sr促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中鈣結(jié)節(jié)表達
　　 實驗組BMSCs加入濃度為3mmol/LSr，對照組BMSCs不加Sr，共同培養(yǎng)21d后，行茜素

12、紅染色。結(jié)果顯示，實驗組鈣結(jié)節(jié)表達高于對照組，表明Sr明顯促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化。
　　 4.Sr對BMP-7表達的影響
　　 0.1-5mmol/LSr在促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化過程中可上調(diào)BMP-7的表達，在0.1-3mmol/L濃度范圍并呈濃度依賴性地促進BMP-7的表達，其中濃度為3mmol/L時BMP-7表達最多，濃度為5mmol/L時促進作用下降，但與對照組相比，差異仍具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001

13、)。相同濃度Sr作用下，在1-7天范圍內(nèi)可呈現(xiàn)時間依賴性地促進BMP-7的表達。與對照組相比，作用第7天時，BMP-7表達最多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。Sr作用10天與第7天相比BMP-7表達雖減少，但與對照組相比，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 5.Sr對OSX表達的影響
　　 Sr濃度在3mmol/L以內(nèi)可上調(diào)OSX基因的表達，其中濃度為1mmol/L時OSX表達最多，當(dāng)Sr濃度為5mmol

14、/L時，對OSX基因的表達成抑制作用，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。1mmol/LSr處理BMSCs不同時間（30分鐘-14天）后呈現(xiàn)時間依賴性地促進OSX基因的表達。與對照組相比，其中Sr處理7天時，OSX基因表達最多，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)，Sr作用14天與第7天相比OSX基因表達雖有減少，但與對照組相比，差異仍有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)。
　　 6.BMP-7阻斷劑noggin對抗Sr誘

15、導(dǎo)的BMSCs成骨分化過程中BMP-7表達
　　 濃度為3mmol/LSr作用BMSCs7天可促進BMP-7表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001)，在Sr處理BMSCs2小時前，應(yīng)用100ng/mlnoggin預(yù)處理細胞可使BMP-7表達減少，與Sr組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。
　　 7.BMP-7阻斷劑noggin對抗Sr誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化過程中ALP活性表達
　　 與對照組相比Sr組AL

16、P活性增高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);在Sr處理BMSCs前2小時，應(yīng)用100ng/mlnoggin處理細胞可使ALP活性較Sr組減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.001);noggin及PBS本身與對照組相比ALP活性無影響，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 8.BMP-7阻斷劑noggin對抗Sr誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化過程中鈣結(jié)節(jié)表達
　　 與對照組相比Sr(3mmol/L處理21天)組鈣結(jié)節(jié)表達

17、增多，在Sr處理BMSCs前2小時，應(yīng)用100ng/mlnoggin可使鈣結(jié)節(jié)較Sr組減少，noggin及PBS本身對鈣結(jié)節(jié)表達無明顯作用。
　　 9.BMP-7阻斷劑noggin對抗Sr誘導(dǎo)的BMSCs成骨分化過程中OSX基因表達
　　 1mmol/LSr作用BMSCs7天明顯地促進OSX基因表達，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)，在Sr處理BMSCs2小時前，應(yīng)用100ng/mlnoggin預(yù)處理細胞可使OSX基因

18、表達減少，與Sr組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.001)。
　　 [結(jié)論]:
　　 本實驗證實在BMSCs向成骨轉(zhuǎn)化過程中，Sr能促進各成骨標(biāo)志物的表達如:ALP活性、鈣結(jié)節(jié)、成骨基因(OSX)等，進一步證實雷奈酸鍶可促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化。Sr促進BMSCs向成骨細胞轉(zhuǎn)化能濃度及時間依賴性地使BMP-7蛋白及OSX基因表達明顯增加。為探討Sr在促進BMSCs向成骨細胞分化過程中與BMP-7表達的關(guān)系。本實驗在Sr作