骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在成神經(jīng)分化過程中的定向遷移研究.pdf

1、目的：惡性膠質(zhì)瘤是目前最為盛行的原發(fā)腦瘤，干細(xì)胞移植極有希望治療膠質(zhì)瘤。因骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體內(nèi)體外均顯示很強(qiáng)的膠質(zhì)瘤趨化性，所以應(yīng)用BMSCs治療膠質(zhì)瘤即是很好的細(xì)胞治療手段。然而，關(guān)于細(xì)胞因子參與BMSCs遷移的報(bào)道卻很少，本研究旨在探討成神經(jīng)分化的BMSCs向C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α（stromal cell—derived factor1α

2、）的遷移行為。 方法：本實(shí)驗(yàn)分三個(gè)階段研究成神經(jīng)分化的BMSCs向C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α的遷移。（1）采用Percoll分離法在體外培養(yǎng)并擴(kuò)增BMSCs，通過免疫熒光染色的方法檢測表面抗原對BMSCs進(jìn)行鑒定。（2）采用抗氧化劑誘導(dǎo)方案誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，即先用濃度為10 ng/ml的bFGF預(yù)誘導(dǎo)24 h，加入濃度為200μM的丁羥基茴香醚（BHA）和2％的二甲基亞砜（DMSO）誘導(dǎo)5h，再用含有N2的H

3、—DMEM維持48 h。觀察誘導(dǎo)分化過程中BMSCs的形態(tài)變化，通過免疫熒光染色檢測誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞特異性標(biāo)志物Nestin、β—Ⅲ—tubulin和NSE的情況。（3）運(yùn)用Dunn chamber研究了分化細(xì)胞在具有濃度梯度的趨化因子中的定向遷移行為。分化不同狀態(tài)BMSCs的遷移通過德國Leica AF6000活細(xì)胞工作站拍攝得到圖像，應(yīng)用NIH Image J分析圖像，每個(gè)分化點(diǎn)隨機(jī)抽取40個(gè)細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)得到細(xì)胞的遷移速率、遷

4、移效率和誘導(dǎo)5 h的遷移軌跡。接著，我們運(yùn)用Boyden chamber研究了BMSCs在成神經(jīng)分化過程中的趨化性遷移（Chemotaxis）和隨機(jī)遷移（Chemokinesis）。以正常培養(yǎng)的BMSCs作為對照，隨機(jī)抽取對照組和實(shí)驗(yàn)組各10個(gè)視野，細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算遷移系數(shù)，遷移系數(shù)=實(shí)驗(yàn)組/對照組。 結(jié)果：（1）采用Percoll淋巴細(xì)胞分離液及不連續(xù)密度梯度法，成功分離培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，可穩(wěn)定傳至20代以上。表型鑒定

5、結(jié)果為CD29、CD71、CD90、CD106呈陽性，CD34、CD45呈陰性。（2）用bFGF/BHA誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，預(yù)誘導(dǎo)24 h，細(xì)胞變成長梭形；誘導(dǎo)5h，細(xì)胞即發(fā)生劇烈的形態(tài)改變，出現(xiàn)胞體回縮、突觸伸展等神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)特征；維持48 h，細(xì)胞出現(xiàn)更多的分叉，并出現(xiàn)二級叉。對照組細(xì)胞無明顯的形態(tài)變化，免疫熒光染色顯示誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)前體細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、β—Ⅲ—tubulin和成熟神經(jīng)元標(biāo)志物NSE。對照組

6、不表達(dá)NSE，誘導(dǎo)組與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0．05）。（3）Dunnchamber分析顯示，C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基組和SDF-1α組誘導(dǎo)細(xì)胞的遷移速率和遷移效率明顯高于對照組，表明C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α對BMSCs具有趨化作用，單個(gè)細(xì)胞遷移軌跡實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了這一結(jié)果。此外，分化不同狀態(tài)的BMSCs向C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α的趨化程度也不同。當(dāng)Boyden上室為L—DMEM懸浮的細(xì)胞，下室為C6細(xì)胞條件培養(yǎng)基時(shí)，分化細(xì)