骨髓間充質(zhì)干細胞在成神經(jīng)分化過程中的定向遷移研究.pdf

1、目的：惡性膠質(zhì)瘤是目前最為盛行的原發(fā)腦瘤，干細胞移植極有希望治療膠質(zhì)瘤。因骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）體內(nèi)體外均顯示很強的膠質(zhì)瘤趨化性，所以應用BMSCs治療膠質(zhì)瘤即是很好的細胞治療手段。然而，關于細胞因子參與BMSCs遷移的報道卻很少，本研究旨在探討成神經(jīng)分化的BMSCs向C6細胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α（stromal cell—derived factor1α

2、）的遷移行為。 方法：本實驗分三個階段研究成神經(jīng)分化的BMSCs向C6細胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α的遷移。（1）采用Percoll分離法在體外培養(yǎng)并擴增BMSCs，通過免疫熒光染色的方法檢測表面抗原對BMSCs進行鑒定。（2）采用抗氧化劑誘導方案誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，即先用濃度為10 ng/ml的bFGF預誘導24 h，加入濃度為200μM的丁羥基茴香醚（BHA）和2％的二甲基亞砜（DMSO）誘導5h，再用含有N2的H

3、—DMEM維持48 h。觀察誘導分化過程中BMSCs的形態(tài)變化，通過免疫熒光染色檢測誘導的細胞表達神經(jīng)細胞特異性標志物Nestin、β—Ⅲ—tubulin和NSE的情況。（3）運用Dunn chamber研究了分化細胞在具有濃度梯度的趨化因子中的定向遷移行為。分化不同狀態(tài)BMSCs的遷移通過德國Leica AF6000活細胞工作站拍攝得到圖像，應用NIH Image J分析圖像，每個分化點隨機抽取40個細胞進行統(tǒng)計得到細胞的遷移速率、遷

4、移效率和誘導5 h的遷移軌跡。接著，我們運用Boyden chamber研究了BMSCs在成神經(jīng)分化過程中的趨化性遷移（Chemotaxis）和隨機遷移（Chemokinesis）。以正常培養(yǎng)的BMSCs作為對照，隨機抽取對照組和實驗組各10個視野，細胞計數(shù)，計算遷移系數(shù)，遷移系數(shù)=實驗組/對照組。 結果：（1）采用Percoll淋巴細胞分離液及不連續(xù)密度梯度法，成功分離培養(yǎng)出大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞，可穩(wěn)定傳至20代以上。表型鑒定

5、結果為CD29、CD71、CD90、CD106呈陽性，CD34、CD45呈陰性。（2）用bFGF/BHA誘導BMSCs向神經(jīng)樣細胞分化，預誘導24 h，細胞變成長梭形；誘導5h，細胞即發(fā)生劇烈的形態(tài)改變，出現(xiàn)胞體回縮、突觸伸展等神經(jīng)細胞的形態(tài)特征；維持48 h，細胞出現(xiàn)更多的分叉，并出現(xiàn)二級叉。對照組細胞無明顯的形態(tài)變化，免疫熒光染色顯示誘導的細胞表達神經(jīng)前體細胞標志物Nestin、β—Ⅲ—tubulin和成熟神經(jīng)元標志物NSE。對照組

6、不表達NSE，誘導組與對照組比較有統(tǒng)計學差異（P＜0．05）。（3）Dunnchamber分析顯示，C6細胞條件培養(yǎng)基組和SDF-1α組誘導細胞的遷移速率和遷移效率明顯高于對照組，表明C6細胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α對BMSCs具有趨化作用，單個細胞遷移軌跡實驗也證實了這一結果。此外，分化不同狀態(tài)的BMSCs向C6細胞條件培養(yǎng)基和SDF-1α的趨化程度也不同。當Boyden上室為L—DMEM懸浮的細胞，下室為C6細胞條件培養(yǎng)基時，分化細