脂質(zhì)體介導(dǎo)BMP2和VEGF165雙基因修飾小鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、目的:通過全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)、分離、純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,構(gòu)建攜帶BMP2和VEGF165基因的重組pYr-adshuttle-4質(zhì)粒,并通過脂質(zhì)體介導(dǎo)將其轉(zhuǎn)染至骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。將轉(zhuǎn)染后的BMSCs進(jìn)行體外培養(yǎng),觀察生物學(xué)特性、向成骨細(xì)胞分化的能力,探討B(tài)MP2和VEGF165雙基因修飾大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與單基因修飾誘導(dǎo)成骨能力的差異。
　　 方法:1.取小鼠雙側(cè)股骨骨髓并采用全骨髓培養(yǎng)法培養(yǎng)進(jìn)行原代培養(yǎng),通過換液和傳代培養(yǎng)分離和純

2、化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,傳至第3代用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.分別構(gòu)建攜帶BMP2和VEGF165基因的重組pYr-adshuttle-4質(zhì)粒。3.按照未轉(zhuǎn)染組、空載體組、BMP2單基因轉(zhuǎn)染組、VEGF165單基因轉(zhuǎn)染組、BMP2和VEGF165雙基因共同轉(zhuǎn)染組通過脂質(zhì)體介導(dǎo)分別轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞。4.轉(zhuǎn)染后行常規(guī)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察7天；48h通過RT-PCR檢測BMP2和VEGF165的mRNA含量,Western-Blot檢測BMP2和VEGF165蛋

3、白表達(dá)變化；轉(zhuǎn)染后一周分別檢測各組細(xì)胞成骨能力—堿性磷酸酶。
　　 結(jié)果:1.全骨髓細(xì)胞培養(yǎng)法成功分離、培養(yǎng)、純化骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,骨髓基質(zhì)干細(xì)胞呈長梭形樣貼壁生長。2.成功構(gòu)建攜帶骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2、血管內(nèi)皮生長因子-165的重組pYr-adshuttle-4質(zhì)粒3.脂質(zhì)體介導(dǎo)成功將攜帶BMP2和VEGF165基因的重組pYr-adshuttle-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞,轉(zhuǎn)染率高,無細(xì)胞毒性作用,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞生長活力增強(qiáng)。4.

4、轉(zhuǎn)染后BMSCs:RT-PCR檢測顯示BMP2+VEGF165雙基因共同轉(zhuǎn)染組mRNA水平表達(dá)高于骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2組和血管內(nèi)皮生長因子-165組單基因轉(zhuǎn)染。5.Western-Blot檢測顯示共同轉(zhuǎn)染組中BMP2和VEGF165基因組在蛋白水平表達(dá)量明顯大于單基因組。6.雙轉(zhuǎn)染組中骨髓基質(zhì)干細(xì)胞的ALP活性明顯高于各單轉(zhuǎn)染組(P<0.05)。
　　 結(jié)論:1.全骨髓培養(yǎng)法成功的培養(yǎng)、分離并純化得到骨髓基質(zhì)干細(xì)胞2.利用脂質(zhì)體介