VEGF165基因修飾HUVECs復(fù)合BMSCs促組織工程骨血管生成的體外實驗研究.pdf

1、目的:由于腫瘤、外傷、感染等原因造成的骨組織缺損是臨床上的常見疾病，機體骨組織由于自身再生修復(fù)能力有限，骨缺損后的修復(fù)一直是一大難題。目前組織工程骨可用于大部分中、小尺寸骨缺損的修復(fù)，在大尺寸骨缺損中使用受限，主要是由于修復(fù)大尺寸的骨缺損時組織工程骨中心部位不能及時的實現(xiàn)早期血管化，中心部位繼而發(fā)生缺血壞死，這將導(dǎo)致修復(fù)失敗。因此可見，組織工程骨能否實現(xiàn)早期血管化直接影響使用組織工程骨修復(fù)骨缺損治療的成敗。新血管生成主要有兩種方式，一種

2、是來源于周圍血管的出芽生長，另一種是由內(nèi)皮細胞形成新生血管。由于早期周圍血管出芽方式形成血管的空間范圍有限，在大塊組織工程骨的中心部位的早期血管化同時需要通過前期移植到人工支架內(nèi)部的內(nèi)皮細胞的遷移、增殖、分化和結(jié)構(gòu)重建形成。有效的組織工程骨早期血管化成為目前亟待解決的難題，如何促進大塊組織工程骨早期血管化也成為目前研究的熱點。種子細胞和生物活性因子是組織工程骨構(gòu)建時的重要要素，目前很多研究證實，通過細胞共培養(yǎng)以及添加生物活性因子來促進血

3、管生成均是很好的促進早期血管化的方法。本研究將腺病毒載體介導(dǎo)VEGF165基因轉(zhuǎn)染臍靜脈內(nèi)皮細胞后與骨髓間充質(zhì)干細胞共同作為組織工程的種子細胞進行體外共培養(yǎng)，并通過觀察處理后臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移、增殖及成管能力來檢測早期成血管能力，為組織工程種子細胞的選擇提供一種新的方案。我們推測VEGF165基因轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞后聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細胞共培養(yǎng)能促進早期血管生成，將二者共同作為種子細胞能更好的促進早期血管化。
　　方法:1.無菌條件下取

4、小鼠雙側(cè)股骨骨髓，采用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)、純化小鼠骨髓間充質(zhì)干細胞。2.將HUVECs按照如下分組:①轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)組:AdVEGF165-HUVECs+BMSCs;②轉(zhuǎn)染非共培養(yǎng)組:AdVEGF165-HUVEC;③空載體共培養(yǎng)組:AdGFP-HUVECs+BMSCs;④空載體組:AdGFP-HUVECs;⑤未轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)組:HUVECs+BMSCs;⑥空白對照組:HUVECs。3.將以上各組利用Transwell間接共培養(yǎng)，通過CCK8

5、檢測實驗檢測臍靜脈內(nèi)皮細胞的生長，繪制細胞活力生長曲線;Transwell實驗檢測各組臍靜脈內(nèi)皮細胞的遷移能力; Matrigel實驗測定臍靜脈內(nèi)皮細胞血管形成能力。
　　結(jié)果:1.全骨髓貼壁法成功分離、純化、骨髓間充質(zhì)干細胞。2.腺病毒成功將攜帶VEGF165基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進臍靜脈內(nèi)皮細胞。3.內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染VEGF165以及將內(nèi)皮細胞和BMSCs共培養(yǎng)后使內(nèi)皮細胞生長活力、遷移能力和成管能力增強。
　　結(jié)論:1.全骨髓