聯(lián)合調(diào)控tPA和VEGF165基因防治移植心臟血管狹窄研究.pdf

1、本論文共分五部分，內(nèi)容如下： 第一部分，目的：克隆人組織纖溶酶原激活物(tPA)基因并構(gòu)建攜帶tPA基因真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/tPA，并研究其有無生物學活性。 方法：用RT-PCR法從人心臟組織中克隆tPA基因并將其克隆至真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中，對pcDNA3.1(+)/tPA進行酶切鑒定和測序。脂質(zhì)體介導pcDNA3.1(+)/tPA轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞(VSMC)，分別用NothernBlo

2、t和斑點印跡法從mRNA和蛋白質(zhì)水平檢測tPA的表達，并用纖維蛋白板法測定表達產(chǎn)物的生物學活性。 結(jié)果：成功地克隆了人tPA基因并構(gòu)建了pcDNA3.1(+)/tPA真核表達質(zhì)粒，測序結(jié)果顯示克隆的全長t-PA基因片段與基因文庫報告一致；pcDNA3.1(+)/tPA轉(zhuǎn)染VSMC后，tPAmRNA和蛋白質(zhì)表達增加，所表達的tPA蛋白質(zhì)具有纖溶活性。 結(jié)論：含t-PA基因新型真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功，讓其轉(zhuǎn)染VSMC后其表達蛋

3、白質(zhì)具有纖溶活性，為利用基因防治移植心臟血管狹窄底實驗研究奠定了基礎(chǔ)。 第二部分，目的：構(gòu)建人VEGF165基因的真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1/VEGF165，觀察其在血管內(nèi)皮細胞(VEC)中的表達和表達產(chǎn)物對VEC增殖的影響。 方法：用RT-PCR法從引產(chǎn)胎兒心臟組織中克隆VEGF165基因，并將其克隆至真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1中，對重組真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1/VEGF165進行酶切鑒定和測序。以脂質(zhì)體

4、轉(zhuǎn)染法將pBudCE4.1/VEGF165導入VEC中，Northernblot和免疫細胞化學染色法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測它們在轉(zhuǎn)染的VEC中的表達，并檢測表達產(chǎn)物對VEC增殖的影響。 結(jié)果：人VEGF165基因的RT-PCR產(chǎn)物為576bp。測序結(jié)果顯示，擴增的VEGF165基因的序列與基因文庫中登錄的序列完全一致。經(jīng)HindⅢ和BamHⅠ酶切鑒定證實，VEGF165基因已成功地克隆至真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1

5、中。以其轉(zhuǎn)染血管平滑肌細胞(VSMC)后，經(jīng)Northernblot雜交和免疫細胞化學染色法檢測均證實VEGF165基因表達。表達產(chǎn)物對VEC增殖有明顯的促進作用。 結(jié)論：所構(gòu)建的pBudCE4.1/VEGF165真核表達質(zhì)粒可在VEC中表達，表達產(chǎn)物可明顯促進VEC增殖，為通過VEGF165基因轉(zhuǎn)染防治移植器官內(nèi)血管的狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第三部分，目的：構(gòu)建攜帶人組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(VEG

6、F165)基因的真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并觀察其在內(nèi)皮細胞(VEC)中的表達。 方法：將tPA和VEGF165基因克隆至真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1中，構(gòu)建共表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165。將pBudCE4.1/tPA-VEGF165轉(zhuǎn)染VEC，用RT-PCR法和Westernblot法分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測被轉(zhuǎn)染的VEC中的tPA和VEGF165表達。

7、結(jié)果：人tPA和VEGF165基因的RT-PCR產(chǎn)物分別為1.9kb和576bp。經(jīng)酶切鑒定證實，tPA和VEGF165基因已克隆至真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1中。以其轉(zhuǎn)染VEC后，經(jīng)RT-PCR法和Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)，tPA和VEGF165在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達。 結(jié)論：成功地構(gòu)建了真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165，并在VEC中表達tPA和VEGF165，為tPA和VEGF165基因

8、轉(zhuǎn)染防治移植器官內(nèi)血管狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第四部分，目的：觀察組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮細胞生長因子165(VEGF165)基因共表達質(zhì)粒在血管平滑肌細胞(VSMC)中的表達，并研究表達產(chǎn)物對血管內(nèi)皮細胞(VEC)和VSMC增殖的影響和纖溶作用。 方法：用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將tPA和VEGF165的共表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165導入VSMC中，逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)和酶聯(lián)免疫吸附

9、實驗(ELISA)分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測tPA和VEGF165的表達；纖溶蛋白板法檢測轉(zhuǎn)染基因的VSMC培養(yǎng)基中tPA的纖溶活性；取轉(zhuǎn)染pBudCE4.1/tPA-VEGF165的VSMC培養(yǎng)基培養(yǎng)VEC和VSMC，用四甲基偶氮唑鹽(MTT)和流式細胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)基因VSMC的細胞培養(yǎng)基對VEC和VSMC增殖的影響。 結(jié)果：pBudCE4.1/tPA-VEGF165轉(zhuǎn)染VSMC后，RT-PCR和ELISA檢測發(fā)現(xiàn)，tP

10、A和VEGF165在mRNA和蛋白質(zhì)水平均有表達；轉(zhuǎn)基因培養(yǎng)基有明顯促進纖溶和促VEC增殖作用，而對VSMC增殖無作用。 結(jié)論：tPA和VEGF165基因共表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165能在VSMC表達有生物學活性的tPA和VEGF165，為tPA和VEGF165基因轉(zhuǎn)染防治移植心臟內(nèi)血管狹窄奠定了基礎(chǔ)。 第五部分，目的：觀察聯(lián)合轉(zhuǎn)染組織纖溶酶原激活物(tPA)和血管內(nèi)皮生長因子165(VEGF165

11、)基因?qū)π∈笠浦残呐K內(nèi)血管狹窄的影響并探討可能機制。 方法：C57BL/6小鼠作為移植供體，Balb/c小鼠作為移植受體，利用顯微外科技術(shù)建立小鼠心臟移植模型。用微注射方法，將攜帶有tPA和VEGF165基因的真核表達質(zhì)粒pBudCE4.1/tPA-VEGF165灌注小鼠移植心臟血管。實驗分為3個組：A組(生理鹽水轉(zhuǎn)染組)；B組(空載質(zhì)粒pBudCE4.1轉(zhuǎn)染組)；C組(攜帶有tPA和VEGF165基因的pBudCE4.1/tP

12、A-VEGF165轉(zhuǎn)染組)。按實驗終點(術(shù)后1d、3d、7w、14d和28d)分為5個亞組。每個實驗終點取移植心臟用于病理學檢測、電鏡觀察、RT-PCR和Western印跡檢查。 結(jié)果：術(shù)后各時間點基因轉(zhuǎn)染組移植心臟tPA和VEGF165基因的mRNA和蛋白質(zhì)表達量明顯高于對照組(P＜0.01)。與對照組比較，術(shù)后各時間點基因轉(zhuǎn)染組移植心臟血管內(nèi)膜面積和狹窄率均顯著減小(P＜0.01)，術(shù)后28d時基因轉(zhuǎn)染組管腔狹窄率比對照組降