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文檔簡介
1、白菜類作物原產我國,栽培歷史悠久且品種豐富。在植物學分類上,白菜類作物隸屬十字花科(Cruciferae)蕓薹屬(Brassica),主要包括大白菜(Brassica rapa ssp.pekinensis)、不結球白菜(Brassica rapa ssp.chinensis)和蕪菁(Brassica rapa ssp.rapa)。其中,不結球白菜是我國長江中下游廣泛種植的大眾蔬菜。與擬南芥一樣,不結球白菜也通過一系列的轉錄調控機制來誘
2、發(fā)冷馴化,從而提高其耐寒性,而由CBF轉錄因子家族基因主導的CBF冷響應通路是這些轉錄調控機制中最重要的組成之一。因而系統(tǒng)的研究CBF冷響應通路對于更好的認識不結球白菜的抗寒甚至其他環(huán)境脅迫的調控機制非常重要。本研究分離和克隆了不結球白菜的CBF基因,分析其脅迫表達模式及調控特點,并進一步研究上游Bc WRKY33對BcCBF3基因的調控關系;通過小RNA測序技術挖掘CBF在關聯(lián)不結球白菜的抗寒和病原響應機制中的作用;此外,對近緣亞種大
3、白菜進行MYB轉錄因子的全基因組鑒定分析,并以此作為對不結球白菜及整個白菜類作物CBF基因上游調控因子MYB的研究的參考。本文主要研究結果如下:
1.從不結球白菜品種‘蘇州青’中分離得到8個CBF同源基因,其編碼的BcCBF蛋白與擬南芥中的同源蛋白相似性較高。實時定量PCR(qPCR)分析表明,BcCBF1~3被冷脅迫(4℃)而非干旱或脫落酸(ABA)誘導,它們參與了ABA-獨立路徑;而BcCBF4~6的表達受到干旱和ABA調
4、控,它們參與ABA-依賴路徑。與擬南芥的同源基因不同,BcCBF4~6表現(xiàn)出的低溫和ABA響應,暗示在不結球白菜中,CBF通路的ABA依賴路徑和ABA獨立路徑并不是完全分開的,而這些基因可能作為兩者的聯(lián)系點。
2.利用Gateway技術構建了4個不結球白菜BcCBF基因的過量表達載體,轉化洋蔥表皮細胞進行亞細胞定位,結果表明這四個BcCBF蛋白都定位在細胞核中。用含有BcCB F3-pEarleyGate103的農桿菌蘸花法轉
5、化擬南芥;通過酶切連接獲得BcCBF3的甘藍縮葉病毒(Cblcv)誘導的基因沉默載體BcCBF3-PCVA并得到不結球白菜的瞬時表達轉基因植株。在擬南芥中,AtCBF2受到BcCBF3過表達顯著抑制,而實時定量分析表明BcCBF2的表達與BcCBF3無直接關系。其上游的BcMYB15則受BcCBF表達量的反饋抑制,下游BcCOR15A表達與BcCBF3正相關并放大其表達的變化。
3.對BcCBF3的啟動子序列進行分析,鑒定出兩
6、個WRKY結合順式元件W-box。鹽處理表達模式及煙草的GUS染色結果表明兩個W-box對于WRKY的結合都有作用。進一步對Bc WRKY33的過量表達不結球白菜中CBF相關基因進行表達分析,結果表明BcWRKY33的組成型表達激活了BcCBF3的轉錄,而在低溫下它們的表達變化都要大于未處理時。BcCBF4在轉基因植株中的表達模式表明雖然它與WRKY33都響應ABA,但彼此對ABA的響應機制是獨立的。此外,BcWRKY33的原核表達獲得
7、了BcWRKY33-GST重組蛋白,為實驗驗證蛋白-DNA互作打下基礎。
4.以感染蕪菁花葉病毒和健康的葉子為材料進行小RNA測序,測序挖掘出86個保守和45個新的的miRNA。其中,共69個miRNA響應TuMV侵染,包括42個下調和27個上調miRNA。利用生物信息學方法預測的共有271個靶基因,這些基因主要參與發(fā)育調控和脅迫響應。選擇了13個miRNA及其相應的靶基因,探索其在TuMV或冷脅迫下的表達模式。結果表明,一些
8、TuMV響應的miRNA也被低溫誘導,其可能作為兩種脅迫響應機制的聯(lián)結。
5.對白菜類作物CBF基因的啟動子順式元件進行分析,結果顯示其都含有MYB結合元件,表明MYB轉錄因子在白菜類作物CBF上游調控中具有普遍性作用。隨后,從大白菜中鑒定出了256個R2R3-MYB基因,通過進化樹分析將大白菜中的273個R2R3-、3R-和非典型的MYB蛋白分成45個亞組。RNA表達譜數(shù)據(jù)和實時定量PCR(qPCR)分析則反映了R2R3-B
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