小鼠體內(nèi)Perlecan∕VEGF-165促進血管生成的實驗研究.pdf

1、血管生成在組織損傷修復(fù)的過程中起著非常重要的作用。新生血管為細胞增殖和組織修復(fù)提供營養(yǎng)和氧離子。血管的生長分化是一個動態(tài)化的復(fù)雜過程，時間和空間上受多種信號分子、細胞外基質(zhì)、間充質(zhì)細胞的嚴格調(diào)控。近來的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)皮細胞參與血管生成，并且內(nèi)皮細胞在血管生成過程起著十分重要的作用。內(nèi)皮細胞上各因子的表達升高或降低可以促進或抑制血管生成。內(nèi)皮細胞成分復(fù)雜，其中Perlecan和VEGF-165是與血管生成關(guān)系密切的主要成分。
　　Per

2、lecan是基底膜上和細胞間質(zhì)中最主要的基底膜蛋白多糖，是一種大分子多結(jié)構(gòu)域的細胞外基底膜蛋白多糖，是脊椎動物最大的單鏈多肽分子之一。Perlecan的蛋白核心結(jié)構(gòu)分為五個區(qū)域，這五個區(qū)域分別與相應(yīng)物質(zhì)的形成有關(guān)，還可以在組織生長、重塑、腫瘤生長過程中改變多肽鏈的形態(tài)從而最大化的發(fā)揮各自的作用。Perlecan存在于大部分的細胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜上，參與調(diào)節(jié)血管生成，具有儲存、保護、加強血管生長因子的功能，在調(diào)節(jié)血管生物學(xué)行為和組

3、織損傷修復(fù)過程中具有很重要的作用。Perlecan參與血管生成過程，新形成的血管周圍可以檢測到Perlecan的高水平表達。
　　血管內(nèi)皮生長因子（VEGF-165）是最先發(fā)現(xiàn)的血管內(nèi)皮生長因子，被認為是血管生長因子家族最典型的代表，它的主要特征是對血管內(nèi)皮細胞起調(diào)控作用，廣泛存在于血管內(nèi)皮。VEGF-165的發(fā)現(xiàn)改變了血管生成領(lǐng)域的研究，能直接誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長，同時VEGF-165還可以和基底膜蛋白多糖的硫酸乙酰肝素鏈結(jié)合促進血

4、管生成。
　　聚乳酸(polylactic acid，PLA)是目前最常采用的構(gòu)建組織工程血管的支架材料。OPLA支架是由D，D-L，L聚乳酸形成的復(fù)合支架，復(fù)合支架本身的三維多孔結(jié)構(gòu)和連通性有利于細胞的粘附、遷移、增殖，具有優(yōu)良的可降解性，可塑性，良好的生物相容性，有利于營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞和支架的血管化，因此我們采用這種支架和Perlecan、VEGF-165相結(jié)合的方法，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，在體研究促進血管生成效果。
　　本課題

5、將提純的Perlecan和VEGF-165植入小鼠體內(nèi)，促進局部血管生成，具有仿生性，可以模擬自身血管生成過程。本實驗的目的在于觀察重組生物材料在具有正常排異反應(yīng)的小鼠體內(nèi)的生物相容性，并分別定性、定量分析復(fù)合支架的促血管生成情況，這樣不僅可以改進現(xiàn)有生物材料和組織工程支架的性能，還很有可能成為一種治療血管損傷、促進血管改型的有效手段，為臨床應(yīng)用進一步提供準確的理論參數(shù)?；诖耍狙芯繉⒅铝τ谘芯繌?fù)合支架的促血管生成性能，使該重組復(fù)合材

6、料具有更深遠更廣泛的實用價值。
　　吳丹已經(jīng)證實Perlecan的制備和純化過程的可靠性以及Perlecan與VEGF-165結(jié)合的穩(wěn)定性和特異性，本實驗鑒于之前的研究成果進一步進行，研究內(nèi)容如下：
　　1.小鼠體內(nèi)重組材料促血管生成的定性分析
　　采用由D，D-L，L聚乳酸形成的復(fù)合支架OPLA，OPLA具有多孔小平面結(jié)構(gòu)，有利于各種因子的吸附。支架分為無處理組和處理組，處理組為：表面吸附 VEGF-165的聚乳酸復(fù)

7、合支架、表面吸附有Perlecan的聚乳酸復(fù)合支架、表面吸附有Perlecan+ VEGF-165的聚乳酸復(fù)合支架；無處理組為OPLA支架。復(fù)合支架植入小鼠體內(nèi)，在特定時間點取出植入材料，HE染色，觀察促血管生成情況，定性分析重組支架的促血管生成效果。我們發(fā)現(xiàn)：隨時間延長OPLA支架逐漸降解，與周圍組織有良好的生物相容性，復(fù)合支架內(nèi)部血管長入逐漸增多，管徑增大，管壁增厚，血管逐漸成熟，血管伴隨組織逐漸深入支架內(nèi)部；支架吸收嚴重。各組都可

8、觀察到血管生成，從HE染色切片上可觀察到處理組的血管生成較多，尤其是OPLA+Perlecan+VEGF-165組最多。
　　2.小鼠體內(nèi)重組材料促血管生成的定量分析
　　通過血管生成的定量分析，發(fā)現(xiàn)對照組在整個實驗過程中微血管密度（MVD）增長最緩慢。OPLA+VEGF-165組在1周時與對照組差異不明顯，2周時增速迅速增大，MVD幾乎是對照組的兩倍，與OPLA+Perlecan組沒有明顯統(tǒng)計學(xué)差異；但第3周時，OPLA+

9、VEGF-165組MVD與對照組已無顯著性差異，與 OPLA+Perlecan組、OPLA+VEGF-165+Perlecan組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，血管生成速度明顯減慢；4周、6周、8周時OPLA+VEGF-165組MVD與OPLA+Perlecan組、OPLA+Perlecan+VEGF-165組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，說明VEGF-165在2周時釋放較快,促血管生成作用在2周時達到高峰。OPLA+Perlecan組與OPLA+Perle

10、can+VEGF-165組在1周時MVD差異不明顯，2周差異有統(tǒng)計學(xué)意義，3周時差異變小，但明顯高于對照組，說明雖然 Perlecan可以很好的促進血管生成，結(jié)合了VEGF-165的Perlecan促血管發(fā)生作用更強，同時從另一個側(cè)面說明了VEGF-165在2周時釋放較快。OPLA+Perlecan+VEGF-165組的MVD均高于OPLA+Perlecan組，1周時，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義；2周時前者MVD明顯高于后者，推測是因為此時