血管生成素-2(AngiopoietiN-2)調(diào)節(jié)小鼠下肢缺血血管生成的研究.pdf

1、目的:研究血管生成素-2（Angiopoietin-2）在下肢缺血模型的實驗小鼠中，對缺血部位血管生成的作用機制。
　　方法:1.建立C57/BL6小鼠下肢缺血模型及腹腔給藥:麻醉實驗小鼠后，經(jīng)股深動脈下緣和胭動脈上緣結(jié)扎實驗小鼠左側(cè)股動脈干支，并且離斷雙結(jié)之間股動脈干支，縫合皮膚，復(fù)溫后，應(yīng)用激光多普勒儀記錄實驗小鼠雙下肢血流灌注情況，在結(jié)扎前(pre)，1d，3d，5d，8d，各記錄一次血流情況。計算左腿與右腿的血流比值，即結(jié)

2、扎側(cè)與非結(jié)扎側(cè)的比值。將實驗小鼠分為兩組，對照組和給藥組，各組為3只實驗小鼠，對照組經(jīng)腹腔注射給予等量的生理鹽水，給藥組腹腔注射重組人血管生成素-2（recombination-human-Ang-2），在結(jié)扎日(1d)，3d，5d，各給藥一次。在第8d處死實驗小鼠，經(jīng)下腔靜脈取抗凝血，離心，取上清液;取雙側(cè)下肢肌肉，包括內(nèi)收肌和腓腸肌。2.ELISA法檢測血清中rh-Ang-2的含量:取實驗小鼠離心后的血清，按ELISA試劑盒操作說明

3、檢測血清中rh-Ang-2的含量。3.實時熒光定量PCR分析待測組織樣品中目的基因的表達:用液氮研磨實驗小鼠肌肉組織，用trizol裂解研碎的組織，傳統(tǒng)法抽提總RNA，瓊脂糖凝膠電泳分析所提RNA質(zhì)量，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，實時熒光定量PCR儀分析目的基因的表達，包括Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，PDGFR-β，VEGF-A，VEGF-C。4.應(yīng)用免疫熒光法分析小鼠肌肉血管生成情況:取小鼠下肢肌肉，以4％多聚甲醛固定，送病理科以

4、石蠟包埋，并制成病理切片，用anti-α-SMA做免疫熒光分析，靶向標(biāo)記血管周細胞，計算新生血管的平均管徑。5.體外血管平滑肌細胞培養(yǎng)研究Ang-2對PDGF-BB信號通路的影響:用培養(yǎng)皿培養(yǎng)人臍靜脈血管平滑肌細胞(HUVSMC)，設(shè)置4各組，分別為空白組(control)，Ang-2組，PDGF-BB組，Ang-2+PDGF-BB組，在無血清培養(yǎng)基情況下，在各組中加入對應(yīng)處理因素，分別做了細胞劃痕實驗和蛋白質(zhì)印跡實驗。6.統(tǒng)計方法:采

5、用spss17.0軟件進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.Ang-2對下肢缺血小鼠模型血流灌注恢復(fù)情況的影響:對照組實驗小鼠內(nèi)收肌血流自結(jié)扎日起，血流逐漸增大，而Ang-2組血流增加不明顯;而相比腓腸肌血流變化，對照組與Ang-2組無明顯差異。2.血清ELISA結(jié)果顯示，對照組血清rh-Ang-2未檢出，Ang-2組血清中檢出rh-Ang-2。3.實時熒光定量PCR結(jié)果顯示，Ang-2組實驗小鼠缺

6、血測內(nèi)收肌中，促血管生長因子Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，VEGF-A，VEGF-C的表達量下降。4.免疫熒光顯示Ang-2組實驗小鼠下肢缺血測內(nèi)收肌平均血管管徑小于對照組。5.細胞劃痕實驗顯示，PDGF-BB組劃痕距離恢復(fù)最快，Ang-2+PDGF-BB次之，Ang-2最慢，Ang-2阻止PDGF-BB誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞遷移;蛋白質(zhì)印跡實驗顯示，Ang-2+PDGF-BB組中PDGFR-β受體的磷酸化被抑制，表明Ang-2

7、阻止PDGF-BB增加的PDGFR-β受體的磷酸化。
　　結(jié)論:1.Ang-2減少下肢缺血灌注，抑制內(nèi)收肌血管的生成與成熟，對腓腸肌血管新生的影響不明顯。2.rh-Ang-2不存在于對照組小鼠中，而存在于給藥組實驗小鼠血清中，并影響其血管生成。3.Ang-2下調(diào)了內(nèi)收肌血管生成中促血管因子Ang-1，Ang-2，PDGF-BB，VEGF-A，VEGF-C的表達。4.Ang-2抑制缺血測內(nèi)收肌平均血管管徑的增大。5.Ang-2減弱或