血管生成素作用機(jī)制探索——血管生成素與卵泡抑素的相互作用——血管生成素與rDNA的結(jié)合及其對(duì)rDNA組蛋白修飾的影響.pdf

1、血管生成素(angiogenin，ANG)是從結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29培養(yǎng)基中分離純化的生長(zhǎng)因子，因其強(qiáng)有力的促血管生成能力而得名。研究表明血管生成素與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及惡化密切相關(guān)。目前，對(duì)血管生成素生物學(xué)功能的作用機(jī)制已有一定的了解，證實(shí)血管生成素可以通過(guò)激活血管生成必需的多個(gè)步驟而促進(jìn)腫瘤新血管的形成和腫瘤的發(fā)生，包括1)血管生成素可與內(nèi)皮細(xì)胞表面的肌動(dòng)蛋白結(jié)合，從而激活細(xì)胞外周的蛋白酶，降解基底膜和胞外基質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞的遷移和侵入

2、其他組織的能力；2)可介導(dǎo)細(xì)胞粘著；3)通過(guò)激活內(nèi)皮細(xì)胞Erk1／2及PKB／Akt通路和平滑肌細(xì)胞JNK／SAPK信號(hào)傳導(dǎo)途徑從而刺激細(xì)胞分裂、分化；4)胞外血管生成素可經(jīng)核轉(zhuǎn)位直接進(jìn)入內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞的細(xì)胞核，并最后積聚在核仁區(qū)促進(jìn)核糖體RNA(rRNA)基因的轉(zhuǎn)錄；5)最近的研究表明，除了內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞外，血管生成素還可經(jīng)核轉(zhuǎn)位進(jìn)入HeLa和PC-3等腫瘤細(xì)胞的核仁區(qū)，促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄和核糖體的形成、直接刺激腫瘤細(xì)胞的增

3、殖和腫瘤生成。 基于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中扮演的重要角色，推測(cè)關(guān)鍵蛋白質(zhì)的相互作用必定介導(dǎo)或調(diào)節(jié)血管生成素促進(jìn)的腫瘤血管生成及腫瘤細(xì)胞增殖等生物學(xué)過(guò)程，但是目前對(duì)血管生成素相互作用蛋白質(zhì)的了解較貧乏。為探索血管生成素功能活動(dòng)中的蛋白質(zhì)相互作用情況，本實(shí)驗(yàn)室曾用酵母雙雜交技術(shù)對(duì)人心肌cDNA文庫(kù)和肝cDNA文庫(kù)進(jìn)行了篩選，獲得了21個(gè)可能與血管生成素相互作用的候選蛋白質(zhì)，其中包括在細(xì)胞分泌、增殖、凋亡等過(guò)程起重要調(diào)節(jié)作用的卵泡

4、抑素(Follistatin，F(xiàn)S)。 第一部分：血管生成素與卵泡抑素的相互作用 為確證血管生成素與卵泡抑素間的相互作用的真實(shí)性，首先利用體外蛋白沉降實(shí)驗(yàn)對(duì)血管生成素與卵泡抑素的相互作用進(jìn)行了驗(yàn)證。在大腸桿菌中表達(dá)帶組氨酸標(biāo)簽的卵泡抑素后，將之與血管生成素蛋白在體外反應(yīng)體系中孵育，然后用Ni珠沉降帶組氨酸標(biāo)簽的卵泡抑素，最后用Western Blot方法檢測(cè)沉降復(fù)合物中是否存在血管生成素。結(jié)果顯示血管生成素可同時(shí)被Ni珠

5、沉降下來(lái)，表明在體外系統(tǒng)中血管生成素可與卵泡抑素直接結(jié)合。 隨后我們研究了血管生成素與卵泡抑素在細(xì)胞環(huán)境下的相互作用。首先構(gòu)建了分別標(biāo)記有藍(lán)綠色熒光蛋白(CFP)和黃色熒光蛋白(YFP)標(biāo)簽的卵泡抑素和血管生成素的真核表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至HeLa細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察他們的定位情況。結(jié)果顯示兩融合蛋白在HeLa細(xì)胞中單獨(dú)表達(dá)時(shí)均勻分布于細(xì)胞核內(nèi)，共表達(dá)后兩蛋白呈顆粒狀共定位于細(xì)胞核內(nèi)的特定部位，說(shuō)明兩者在細(xì)胞環(huán)境中有相互作用，

6、且相互作用使各自的細(xì)胞內(nèi)定位發(fā)生了改變。熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了血管生成素與卵泡抑素在HeLa細(xì)胞核內(nèi)的相互作用。在確證卵泡抑素與血管生成素的相互作用后，我們進(jìn)一步研究了卵泡抑素上與血管生成素的作用位點(diǎn)。成熟的卵泡抑素蛋白包含N端結(jié)構(gòu)域和隨后的三個(gè)結(jié)構(gòu)非常相似的FS1、FS2和FS3結(jié)構(gòu)域。我們通過(guò)PCR擴(kuò)增得到各種卵泡抑素的缺失突變體基因，在酵母雙雜交系統(tǒng)中檢測(cè)各突變體與血管生成素是否有相互作用。結(jié)果顯示，卵泡抑素

7、的FS2和FS3結(jié)構(gòu)域共同介導(dǎo)了卵泡抑素與血管生成素的相互作用。 卵泡抑素一直被認(rèn)為是一個(gè)分泌蛋白質(zhì)，其核定位現(xiàn)象是本研究的一個(gè)創(chuàng)新性發(fā)現(xiàn)。為進(jìn)一步研究產(chǎn)生該現(xiàn)象的機(jī)制，本論文采用CFP為熒光標(biāo)簽，以直觀地觀察蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況；同時(shí)收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清，Western Blot方法檢測(cè)蛋白質(zhì)的分泌情況。為研究生理情況下即帶信號(hào)肽的卵泡抑素合成后在細(xì)胞內(nèi)的定位情況，首先將帶有信號(hào)肽的FS基因與CFP基因融合并在HeLa細(xì)胞中表

8、達(dá)，結(jié)果顯示，卵泡抑素一部分經(jīng)分泌途徑分泌至細(xì)胞外，另一部分則定位于細(xì)胞核內(nèi)。我們知道，一些蛋白的翻譯可以從不同位置的甲硫氨酸開始，從而導(dǎo)致所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)不同的細(xì)胞內(nèi)定位。對(duì)卵泡抑素氨基酸序列分析顯示其前端信號(hào)肽中有2個(gè)甲硫氨酸，分別位于-29位和-8位。將兩個(gè)甲硫氨酸分別突變后HeLa細(xì)胞內(nèi)表達(dá)結(jié)果表明，-29位甲硫氨酸突變后，卵泡抑素不能分泌出細(xì)胞，全部定位于細(xì)胞核內(nèi)；而-8位甲硫氨酸突變后，蛋白則全部經(jīng)分泌途徑分泌至細(xì)胞外。可見，

9、卵泡抑素可從其信號(hào)肽中的不同甲硫氨酸開始翻譯，導(dǎo)致蛋白細(xì)胞內(nèi)的不同定位。隨后我們對(duì)-29位突變體與血管生成素的相互作用進(jìn)行了共定位和FRET研究。結(jié)果顯示，兩蛋白呈顆粒狀共定位于細(xì)胞核內(nèi)的特定部位，F(xiàn)RET實(shí)驗(yàn)則再次證實(shí)了兩蛋白的核內(nèi)相互作用。以上結(jié)果清楚表明，從-8位甲硫氨酸開始翻譯的卵泡抑素進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并與核內(nèi)的血管生成素發(fā)生相互作用。為確定卵泡抑素蛋白核定位序列，用PCR技術(shù)擴(kuò)增得到多個(gè)卵泡抑素的缺失突變體，將這些突變體基因與C

10、FP基因融合并在HeLa細(xì)胞中表達(dá)，激光共聚焦顯微鏡下觀察各融合蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位情況。結(jié)果表明，卵泡抑素的FS1結(jié)構(gòu)域N端的64-100位氨基酸在卵泡抑素進(jìn)核過(guò)程中發(fā)揮重要作用。 隨后對(duì)卵泡抑素與血管生成素相互作用的生物學(xué)意義進(jìn)行了研究。已知血管生成素可與ABE序列結(jié)合并促進(jìn)ABE的啟動(dòng)子活性。卵泡抑素與血管生成素的核內(nèi)相互作用使我們有理由推測(cè)卵泡抑素可能對(duì)血管生成素的促轉(zhuǎn)錄活性有調(diào)節(jié)能力。為此，本論文利用ABE-熒光素酶報(bào)告系

11、統(tǒng)對(duì)該推測(cè)進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果表明，ABE序列在檢測(cè)啟動(dòng)子活性的質(zhì)粒pGL3E中表現(xiàn)出啟動(dòng)子活性，熒光素酶表達(dá)量約為pGL3E空質(zhì)粒組的3.14倍；同時(shí)表達(dá)血管生成素后，熒光素酶表達(dá)量顯著升高，約為pGL3E空質(zhì)粒組的8.02倍，說(shuō)明血管生成素可促進(jìn)ABE的啟動(dòng)子活性；卵泡抑素的表達(dá)對(duì)ABE的啟動(dòng)子活性沒有顯著影響(約為pGL3E空質(zhì)粒組的3.76倍)；但當(dāng)卵泡抑素和血管生成素共表達(dá)時(shí)，熒光素酶表達(dá)量顯著降低，約為pGL3E空質(zhì)粒組的2.6

12、9倍，與血管生成素單獨(dú)表達(dá)組相比有顯著性差異(t檢驗(yàn)，P<0.05)，說(shuō)明卵泡抑素與血管生成素的相互作用抑制了血管生成素的促ABE轉(zhuǎn)錄活性。 第二部分：血管生成素與rDNA的結(jié)合及其對(duì)rDNA區(qū)組蛋白修飾的影響 為探索確定血管生成素的體內(nèi)rRNA基因(rDNA)區(qū)的結(jié)合序列，我們利用染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)(ChIP)研究了血管生成素與rDNA各段區(qū)域的結(jié)合程度。本文首先利用血管生成素的兔多克隆抗體對(duì)HeLa細(xì)胞的核裂解液進(jìn)行

13、染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，以未加抗體沉降組為對(duì)照。然后以染色質(zhì)免疫沉淀的產(chǎn)物為模板，用SYBR Green熒光定量PCR法針對(duì)rDNA各段(啟動(dòng)子區(qū)、18S區(qū)、28S區(qū)、ABE區(qū)、基因間區(qū))進(jìn)行擴(kuò)增，以確定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段含量的比值，這個(gè)比值即間接反應(yīng)了血管生成素與rDNA的結(jié)合程度。結(jié)果顯示，用血管生成素抗體免疫沉淀得到的DNA中，rDNA各段含量與對(duì)照組相比均有2-3倍左右的升高，表明血管生成素與rDNA各段

14、均有不同程度結(jié)合。隨后我們進(jìn)一步研究了用血管生成素處理前后HeLa細(xì)胞中血管生成素與rDNA各段的結(jié)合程度的變化。我們將HeLa細(xì)胞分為兩組，一組外加血管生成素處理，另一組未處理為對(duì)照，兩組用等量血管生成素抗體進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，熒光定量PCR法檢測(cè)兩組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段的含量的比值。結(jié)果表明，與未處理組相比，血管生成素處理后其與rDNA各段的結(jié)合均有4倍左右的升高，從而進(jìn)一步證明了血管生成素與rDNA的結(jié)合。

15、 隨后我們對(duì)血管生成素與rDNA整段結(jié)合的意義進(jìn)行了探討。已有研究表明，許多rRNA轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子都可通過(guò)影響rDNA不同區(qū)域組蛋白乙酰化和／或甲基化的程度，從而調(diào)節(jié)rRNA的轉(zhuǎn)錄。另外一些與rDNA整段結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，如UBF也具有調(diào)節(jié)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用。因此，我們推測(cè)血管生成素與整段rDNA的結(jié)合也可能影響染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)。我們?nèi)匀贿\(yùn)用染色質(zhì)免疫沉淀法，研究了血管生成素對(duì)rDNA區(qū)各段組蛋白H4乙?；潭燃癏3第9位賴氨酸(H3K9)二甲基

16、化程度的影響。首先我們構(gòu)建了表達(dá)血管生成素mRNA反義鏈的HeLa細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株(轉(zhuǎn)染空載體為對(duì)照)，從而抑制內(nèi)源血管生成素的表達(dá)。然后分別用乙?；疕4抗體和H3K9二甲基化抗體對(duì)血管生成素抑制組與對(duì)照組進(jìn)行染色質(zhì)免疫沉淀，熒光定量PCR法測(cè)定兩組染色質(zhì)免疫沉淀產(chǎn)物中rDNA各段含量的比值，該比值即反應(yīng)了rDNA各段H4乙?；虷3甲基化程度的改變。結(jié)果表明，抑制血管生成素蛋白表達(dá)的HeLa細(xì)胞株rDNA各段H4乙?；潭染鶞p低，為對(duì)照

17、組的0.5倍左右；rDNA各段H3K9二甲基化程度均有輕弱的升高，約為對(duì)照組的1.2-1.7倍不等。H4的乙?；纱龠M(jìn)常染色質(zhì)的形成和轉(zhuǎn)錄的進(jìn)行，而H3K9二甲基化作用則相反。因此我們推測(cè)血管生成素可能通過(guò)促進(jìn)H4乙?；?、減弱H3K9二甲基化程度而改變?nèi)旧|(zhì)結(jié)構(gòu)，從而促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄。 基于以上兩部分研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1.從信號(hào)肽上的第二個(gè)AUG開始翻譯的卵泡抑素進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，與核內(nèi)的血管生成素相互作用。