血管生成素與磷脂混雜酶1相互作用及其功能研究.pdf

1、血管生成素(Angiogenin，ANG)能夠促進(jìn)血管新生和腫瘤增殖，然而作用機(jī)制未明。由于蛋白質(zhì)相互作用在生命活動(dòng)中扮演關(guān)鍵角色，研究ANG相互作用蛋白質(zhì)將是闡明其作用機(jī)制的有效途徑。 酵母雙雜交技術(shù)是目前被普遍采用的高通量篩選相互作用蛋白質(zhì)的方法之一。在前期工作中，本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)成功地用酵母雙雜交法從人心肌cDNA文庫篩選到22個(gè)與ANG存在相互作用的蛋白質(zhì)?？紤]到肝臟是ANG的主要合成臟器，也為了發(fā)現(xiàn)更多的ANG相互作用蛋

2、白質(zhì)，本論文再次利用酵母雙雜交方法對(duì)人肝cDNA文庫進(jìn)行了篩選，并獲得了8個(gè)能夠與ANG在酵母細(xì)胞中發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)，其中有4個(gè)與從心肌cDNA文庫中篩選到的蛋白質(zhì)一致。這些與血管生成素有潛在相互作用的新蛋白的發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)充了實(shí)驗(yàn)室前期發(fā)現(xiàn)的血管生成素相互作用蛋白數(shù)據(jù)庫，為探索血管生成素作用機(jī)制提供了新的線索。 磷脂混雜酶1(phospholipidscramblase1，PLSCR1)是此次篩選到的ANG相互作用蛋白之一。它

3、是一個(gè)Ⅱ型膜蛋白，最初因其磷脂混雜酶活性而得名。近年來的研究發(fā)現(xiàn)PLSCR1能夠轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)，但其在細(xì)胞核內(nèi)行使的生物學(xué)功能尚不明確。 酵母雙雜交系統(tǒng)顯示的相互作用蛋白還需要利用其它研究蛋白質(zhì)相互作用的方法進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，我們首先采用體外GST沉降(GST—pulldown)以及體內(nèi)免疫共沉淀(co—immunoprecipitation)技術(shù)證明了PLSCR1與ANG相互作用的真實(shí)性。為了進(jìn)一步了解PLSCR1在細(xì)胞內(nèi)的

4、定位以及與ANG的共定位情況，我們用熒光蛋白CFP和YFP分別標(biāo)記PLSCR1和ANG，通過轉(zhuǎn)染方法在HeLa細(xì)胞內(nèi)實(shí)現(xiàn)高表達(dá)后，用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，融合蛋白CFP—PLSCR1和YFP—ANG明顯地共定位于細(xì)胞核。經(jīng)FRET分析證實(shí)，兩者能夠在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生相互作用。此外，為排除標(biāo)簽蛋白CFP和YFP對(duì)目標(biāo)蛋白定位的影響，我們采用間接免疫熒光方法以及細(xì)胞核免疫共沉淀的方法檢測(cè)到不帶熒光蛋白標(biāo)簽的PLSCR1與ANG也能

5、夠在細(xì)胞核內(nèi)共定位并發(fā)生相互作用。 已知細(xì)胞核內(nèi)的ANG具有促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄的活性；ANG的核轉(zhuǎn)位及其促rRNA轉(zhuǎn)錄活性是ANG誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和血管新生的基礎(chǔ)。然而到目前為止，ANG在細(xì)胞核內(nèi)促進(jìn)rRNA轉(zhuǎn)錄以及調(diào)節(jié)ANG促rRNA轉(zhuǎn)錄過程的分子機(jī)制均未明了。基于PLSCR1能夠與ANG在細(xì)胞核內(nèi)發(fā)生相互作用，我們進(jìn)一步檢測(cè)了PLSCR1對(duì)ANG促進(jìn)的rRNA轉(zhuǎn)錄活性的影響。結(jié)果顯示，在HeLa細(xì)胞內(nèi)，PLSCR1水平與rRNA

6、的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)，且過表達(dá)PLSCR1引起的rRNA轉(zhuǎn)錄活性增加必須依賴于細(xì)胞內(nèi)ANG的存在。因而，我們認(rèn)為PLSCR1能夠增強(qiáng)ANG促進(jìn)的rRNA轉(zhuǎn)錄活性。 基于以上研究結(jié)果，我們得出如下結(jié)論： 1．顆粒蛋白(granulin，GRN)、纖黏連蛋白1(fibronectin1，F(xiàn)N1)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)降解途徑相關(guān)的泛素連接酶HRD1(ERAD—associatedE3ubiquitin—proteinligaseHRD1

7、)、血管內(nèi)皮緊張素(vascularendothelialstatin，VE—statin)、潛在型TGF—β結(jié)合蛋白3(latenttransforminggrowthfactorbetabindingprotein3，LTBP3)、磷脂混雜酶1、Sprouty1(Spry1)和脊索蛋白(chordin，CHRD)等是用酵母雙雜交技術(shù)從人肝cDNA文庫中篩選到的8種潛在的ANG相互作用蛋白質(zhì)。 2．PLSCR1是ANG在He