血小板生成素受體（Mp1）胞外區(qū)與XP1的相互作用.pdf

1、　　本課題進行了以下工作：1.GST-Mpl-EC融合蛋白原核表達質粒的構建。PCR法擴增Mpl-ECcDNA，將其構建到已經(jīng)連有GST標記的原核表達載體pET-28b質粒中，與GST基因構成融合基因，并保持靶基因的閱讀框不變。PCR及酶切鑒定正確，而且DNA測序結果表明，重組質粒中多肽cDNA堿基序列和閱讀框均正確，重組質粒成功。2.GST-Mpl-EC融合蛋白的原核表達。將重組質粒pET28b-GST-Mpl-EC轉化入大腸桿菌BL

2、-21中，在室溫下IPTG誘導4h，SDS-PAGE檢測蛋白表達，發(fā)現(xiàn)有可溶的GST-Mpl-EC融合蛋白表達，分子量約為90kDa，再依此條件大量誘導表達，并將可溶蛋白用谷胱甘肽-瓊脂糖樹脂進行免疫親和純化，得到可溶的純度較高的GST-Mpl-EC融合蛋白。3.XP1及其缺失突變體原核表達質粒的構建和表達利用PCR和DNA重組技術，對XP1進行了N-端、C-端和中央?yún)^(qū)的缺失突變，并連同全長的XP1，分別構建到原核表達載體pET-28b

3、質粒中，在大腸桿菌中表達。4.Mpl-EC及其缺失突變體原核表達質粒的構建和表達將Mpl-EC的兩個亞單元分別克隆出來，通過DNA重組技術，分別構建到重組原核表達載體pET28b-GST質粒中，并在大腸桿菌中表達。5.用GSTPull-down體外實驗鑒定XP1和Mpl-EC蛋白間的相互作用將GST-Mpl-EC融合蛋白固化在谷胱甘肽親和樹脂上，充當誘餌蛋白，再用重組XP1或人類巨噬細胞裂解液過柱，通過蛋白間相互作用捕獲蛋白，洗脫后用S