血小板生成素受體激動(dòng)劑對慢性ITP FcγRs的調(diào)控研究.pdf

1、背景:Fcγ受體（Fc gamma receptors，F(xiàn)cγRs）是一種在體內(nèi)多種細(xì)胞表面表達(dá)的糖蛋白，屬于免疫球蛋白超家族的成員，F(xiàn)cγ受體與IgG的Fc段特異性結(jié)合，引發(fā)多種免疫反應(yīng)，是非常重要的免疫調(diào)節(jié)分子，不僅維持機(jī)體的正常生理平衡，在免疫損傷、炎癥性疾病和腫瘤的發(fā)病及進(jìn)展過程中起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。人類FcγRs分三類，即FcγRⅠ/CD64、FcγPⅡ/CD32和FcγRⅢ/CD16，根據(jù)它們對免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)作用的不同又分

2、為活化型受體(FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅢ)和抑制型受體（FcγRⅡb）。FcγRⅠ分布在單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及中性粒細(xì)胞表面，是唯一的高親和力Fcγ受體。FcγRⅡ分FcγRⅡa和FcγRⅡb兩種亞型，主要與聚合IgG相結(jié)合，具有低到中度親和力，廣泛表達(dá)于單核細(xì)胞、樹突細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞(naural killer cell，NK)、中性粒細(xì)胞及血小板等。FcγRⅢ結(jié)合單體IgG能力較弱，與聚合IgG有低到中度結(jié)合力，

3、主要在單核/巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、NK細(xì)胞表面表達(dá)。FcγR的胞內(nèi)段包含免疫受體絡(luò)氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activating motif,ITAM)和抑制基序(ITIM)，活化型抑或抑制型受體性質(zhì)取決于此?；罨褪荏w與相應(yīng)配體IgG-Fc結(jié)合，Src家族蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases，PTKs)活化使ITAM磷酸化，引起Syk蛋白募集，激活磷脂酰肌醇3

4、-激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K），產(chǎn)生磷脂酰肌醇3，4，5，-三磷酸(phosphatidylinositol3，4，5-trisphosphate，PIP3)，后者活化酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，BTK)和磷脂酶Cγ(phospholipase Cγ，PLCγ)，產(chǎn)生二酰甘油(diacylglycerol,DAG)和肌醇三磷酸(inositol tripho

5、sphate，IP3)，細(xì)胞膜的離子通道開放，鈣離子內(nèi)流，從而引發(fā)一系列免疫細(xì)胞活化反應(yīng)，包括單核/巨噬細(xì)胞吞噬作用、抗體依賴的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒作用（antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，ADCC）及細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)釋放等。FcγRⅡb是Fcγ受體中唯一抑制型受體，免疫復(fù)合物與FcγRⅡb結(jié)合后，激活胞內(nèi)ITIM信號(hào)，引起Src家族酪氨酸激酶去磷酸化，阻止活化信號(hào)傳遞，抑制機(jī)體免疫

6、反應(yīng)。另外，F(xiàn)cγRⅡb還可以抑制B細(xì)胞增殖、促進(jìn)B細(xì)胞凋亡，從而維持機(jī)體免疫耐受。細(xì)胞表面往往同時(shí)表達(dá)活化型和抑制型Fcγ受體，細(xì)胞反應(yīng)結(jié)果是兩種受體比值決定的，很多因素可以影響兩種受體的比例，這就可能導(dǎo)致機(jī)體免疫反應(yīng)異常從而引發(fā)自身免疫病。目前大量研究證實(shí)，多種自身免疫病包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、多發(fā)性硬化(multiple sclerosis，MS)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rh

7、eumatoid arthritis，RA)、原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia，ITP)等都存在FcγR表達(dá)失衡，表現(xiàn)在活化型受體FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅢ的表達(dá)升高而抑制型受體FcγRⅡb表達(dá)降低?；罨秃鸵种菩虵cγR的比例失衡在自身免疫病發(fā)生發(fā)展中起至關(guān)重要的作用，因此調(diào)節(jié)兩種受體平衡是保持免疫耐受和治療自身免疫病的有效途徑。
　　ITP以往稱為特發(fā)性血小板減少

8、性紫癜(idiopathic thrombocytopenic purpura)，現(xiàn)根據(jù)本病病因不明、免疫相關(guān)及出血表現(xiàn)不一等更名為原發(fā)免疫性血小板減少癥(primary immune thrombocytopenia)，是最常見的出血性疾病，占臨床出血性疾病的1/3。臨床多表現(xiàn)在皮膚黏膜出血、鼻出血、牙齦出血及女性月經(jīng)過多，嚴(yán)重時(shí)可出現(xiàn)臟器出血、顱內(nèi)出血等致命性出血。出血嚴(yán)重程度與血小板數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，另外某些其他因素如年齡、機(jī)體狀況、

9、生活環(huán)境等也與出血風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。按病程長短ITP分為新診斷、持續(xù)性（3-12個(gè)月）和慢性（≥12個(gè)月）三大類。研究表明ITP是一種自身免疫病，機(jī)體免疫效應(yīng)細(xì)胞過度反應(yīng)，產(chǎn)生針對血小板糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ的特異性IgG，其與血小板結(jié)合后作用于單核細(xì)胞表面FcγR，通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被巨噬細(xì)胞吞噬，引起血小板的破壞。目前研究顯示體液和細(xì)胞免疫介導(dǎo)的巨核細(xì)胞數(shù)量及質(zhì)量異常所致血小板生成減少也在ITP發(fā)病中起重要作用。另外其他多種免疫失

10、衡如Th1/Th2改變、Th17異常、細(xì)胞毒性T細(xì)胞直接破壞及T細(xì)胞抗原受體(T cell antigen receptor，TCR)基因表達(dá)變化等機(jī)制均可能參與了ITP的發(fā)病過程，確切發(fā)病機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　目前ITP的治療主要針對阻止血小板過度破壞和促使血小板的生成兩種途徑，包括糖皮質(zhì)激素、免疫球蛋白、脾切除、利妥昔單抗等免疫抑制治療和促血小板生成素治療，通常ITP對上述治療有效，但容易反復(fù)，需要多療程控制，長期治療

11、伴隨骨質(zhì)疏松、高血壓、免疫低下、嚴(yán)重感染等副作用。仍有約1/3患者遷延不愈，成為慢性ITP。
　　ITP是最經(jīng)典的Fcγ受體介導(dǎo)的自身免疫性疾病之一，已有研究證明活化型受體上調(diào)和抑制型受體下調(diào)是ITP患者發(fā)病的基礎(chǔ)，同時(shí)伴隨著ITP治療有效，F(xiàn)cγR平衡趨向恢復(fù)。Samuelsson等應(yīng)用靜脈注射免疫球蛋白(intravenous immunoglobulin，IVIg)治療小鼠ITP，發(fā)現(xiàn)隨著血小板恢復(fù)，小鼠脾巨噬細(xì)胞FcγRⅡ

12、b表達(dá)上升。Ashi發(fā)現(xiàn)對清除幽門螺桿菌治療有效的ITP患者單核細(xì)胞活化型受體FcγRⅠ和FcγRⅡa表達(dá)下降而抑制型受體FcγRⅡb表達(dá)上升，治療無效患者沒有類似反應(yīng)，說明清除幽門螺桿菌有利于恢復(fù)FcγR平衡從而治療ITP。劉新光等研究了大劑量地塞米松治療ITP患者前后FcγRs的表達(dá)，證實(shí)地塞米松影響Fcγ受體特別是抑制型FcγRⅡb表達(dá)。目前為止沒有關(guān)于TPO-RAs對慢性ITP患者FcγRs表達(dá)影響的研究報(bào)道。
　　目的:

13、檢測慢性ITP患者應(yīng)用艾曲波帕治療前后外周血單核細(xì)胞FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ分子表達(dá)及FcγRⅡa、Ⅱb mRNA水平變化;體外觀察ITP患者治療前后單核細(xì)胞吞噬自身血小板的能力變化;檢測ITP小鼠注射羅米司亭前后單核/巨噬細(xì)胞FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅲ表達(dá)變化，探討TPO-RAs對FcγRs系統(tǒng)的調(diào)控機(jī)制。
　　方法:1.ITP患者治療前后及健康對照外周血的準(zhǔn)備:慢性ITP患者21例，健康對照者20例，分別于艾曲波帕服用前、服用6周后抽取外周

14、血，分離單個(gè)核細(xì)胞和血漿。
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測外周血CD14+單核細(xì)胞表面FcγRⅠ、Ⅱ、Ⅱb和Ⅲ表達(dá);免疫磁珠分離CD14+單核細(xì)胞，實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)測定FcγRⅡa、Ⅱb mRNA水平;酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent as

15、say,ELISA)檢測ITP患者治療前后和正常對照血漿中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的水平。
　　結(jié)果:1.21位慢性ITP患者經(jīng)艾曲波帕治療6周后，治療有效者占71.43％，其中完全緩解者占28.57％，治療無效者占28.57％。
　　2.流式檢測結(jié)果表明:艾曲波帕治療6周后，ITP患者單核細(xì)胞FcγRⅠ表達(dá)明顯降低，F(xiàn)cγRⅡb表達(dá)明顯升高，F(xiàn)cγRⅡ和

16、FcγRⅢ的表達(dá)較治療前無顯著變化。在治療有效組中，F(xiàn)cγRⅡb的表達(dá)較治療前明顯升高，F(xiàn)cγRⅠ表達(dá)明顯降低;治療無效組中，F(xiàn)cγRⅠ、FcγRⅡ和FcγRⅡb的表達(dá)治療前后均無顯著性差異;FcγRⅢ的表達(dá)在治療有效組及無效組中均無顯著變化。
　　結(jié)論:1.血小板生成素受體激動(dòng)劑(TPO-RAs)艾曲波帕治療慢性ITP反應(yīng)率高，耐受性好。
　　2.艾曲波帕治療慢性ITP患者6周后，單核細(xì)胞活化型受體FcγRⅠ表達(dá)下降，抑制

17、型受體FcγRⅡb表達(dá)上升，F(xiàn)cγRⅡa/Ⅱb mRNA比值明顯下降。
　　3.艾曲波帕治療有效后，隨著ITP患者單核細(xì)胞抑制型受體FcγRⅡb表達(dá)回升，單核/巨噬細(xì)胞吞噬自身致敏血小板的能力下降。
　　4.艾曲波帕治療有效患者血漿抗炎細(xì)胞因子TGF-β1濃度升高，單核細(xì)胞FcγRs平衡恢復(fù)。
　　5.血小板生成素受體激動(dòng)劑羅米司亭治療ITP小鼠后，血小板數(shù)值的恢復(fù)伴隨單核/巨噬細(xì)胞活化型受體FcγRⅠ表達(dá)下降和抑制型