FcγRs在ITP中的表達及調(diào)控研究.pdf

1、研究背景：人Fcγ受體系統(tǒng)由活化性受體(FcγRⅠ，Ⅱa，Ⅲ)和抑制性受體(FcγRⅡb)兩個家族組成，這兩類作用相反的受體平衡一旦失調(diào)會導致許多自身免疫性疾病的發(fā)生?？乖?IgG免疫復合物(IC)通過作用于免疫細胞上IgG恒定區(qū)Fcγ受體誘發(fā)多種免疫反應(yīng)。根據(jù)RNA剪接異構(gòu)體和蛋白結(jié)構(gòu)不同，人類FcγR系統(tǒng)可分為FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ三個亞群。FcγRⅠ又稱CD64，為高親和力的IgG受體，主要表達與單核細胞和巨噬細胞；F

2、cγRⅢ即CD16，與單體IgG結(jié)合力較弱，但同IgG聚合體有中低度的親和力，其主要表達于中性粒細胞、單核/巨噬細胞、自然殺傷細胞：FcγRⅡ又稱CD32，按功能可進一步分為FcγRⅡa和FcγRⅡb兩個亞型，為低到中親和力的IgG受體，主要與聚合的IgG結(jié)合，表達于中性粒細胞、單核/巨噬細胞、樹突狀細胞(DCs)、B細胞和血小板。按功能學分類，人FcγR系統(tǒng)可分為活化性FcγR和抑制性FcγR兩個家族。FcγRⅡb為唯一抑制性的Fcγ

3、受體，主要通過自身分子胞漿區(qū)偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸抑制基序(ITIM)傳遞抑制信號，在固有免疫和適應(yīng)性免疫方面發(fā)揮重要負性調(diào)節(jié)作用；其余的FcTRⅠ、Ⅱa、Ⅲ均為活化性Fcγ受體，大都通過偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸活化基序(ITAM)的γ二聚體傳遞活化信號。Fcγ受體信號通路在多種自身免疫性疾病的發(fā)生及進展中發(fā)揮重要作用。多篇報道顯示：在風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、多發(fā)性硬化(MS)、自身免疫性溶血性貧血(autoimm

4、une hemolytic anemia)等自身免疫性疾病中，往往可以發(fā)現(xiàn)活化性受體FcγRⅡa、FcγRⅠ的表達下調(diào)及抑制性受體FcγRⅡb的表達上調(diào)，故活化性和抑制性Fcγ受體失衡在自身免疫性疾病的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。
　　 原發(fā)性免疫性血小板減少癥(ITP)，以往亦稱為特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，是臨床最為常見的出血性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30％。ITP臨床表現(xiàn)為皮膚粘膜出血，月經(jīng)過多，內(nèi)臟出血，甚至顱內(nèi)出血

5、，嚴重影響人類健康。其發(fā)病機制主要為機體自身免疫耐受失衡，產(chǎn)生了針對血小板糖蛋白(GP)特異性的自身抗體，大部分主要為針對GPⅡb/Ⅲa和/或GPⅠb/Ⅸ的IgG，該抗體與血小板膜自身GP抗原結(jié)合，通過作用于單核巨噬細胞Fcγ受體(FcγR)在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)被巨噬細胞吞噬而過度清除。自身抗體的產(chǎn)生、激活、維持由表達FcγR的免疫細胞共同參與完成，是眾多自身免疫性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)。除上述經(jīng)典的抗體介導的血小板異常破壞途徑外，多種細胞免

6、疫機制異常，如Th1/Th2失衡、Th17亞群異常、細胞毒性T細胞(CTL)介導的血小板破壞、調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量或抑制功能異常等參與了ITP發(fā)病的異常病理生理過程，但上述異常的具體原因亟待明確。目前，對于ITP的治療以糖皮質(zhì)激素、脾切除、大劑量丙種球蛋白、免疫抑制劑等治療為主，容易產(chǎn)生感染、骨髓抑制等副作用，約有1/3的患者對上述治療無效，成為難治性ITP，常常遷延不愈，甚至危及生命。因此，深入了解ITP的發(fā)病機制，探討阻斷ITP特異發(fā)病

7、途徑并尋找新的藥物作用靶點對發(fā)展新的ITP的治療策略有重要意義。
　　 ITP是最經(jīng)典的一種Fcγ受體介導的自身免疫性出血性疾病。做為FcγRs系統(tǒng)中唯一的抑制性受體，F(xiàn)cγRⅡb在ITP的免疫負性調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。Ashi最近報道顯示：對清除幽門螺桿菌療法有反應(yīng)的ITP患者中，可以發(fā)現(xiàn)單核細胞抑制性受體FcγRⅡb的表達上調(diào)及活化性受體FcγRⅡa、FcγRⅠ的表達下調(diào)，而清除幽門螺桿菌療法無反應(yīng)的ITP患者中并不伴有該種變

8、化，這提示幽門螺桿菌清除后可以通過恢復FcγRs受體平衡來緩解ITP病情。動物實驗亦證實：過表達FcγRⅡa的轉(zhuǎn)基因小鼠可顯著加重抗體介導的血小板減少。此外，F(xiàn)cγRⅡa、Ⅱb亦參與抗體、補體介導的炎癥反應(yīng)：Shushakova研究顯示C5a可直接上調(diào)肺泡巨噬細胞FcγRⅡb的表達。小鼠模型中，可溶性抗原特異的IgG可成功治療ITP。大劑量丙種球蛋白靜脈滴注(ⅣIg)已成功用于人類包括ITP在內(nèi)的多種自身免疫性疾病中，且療效機制研究發(fā)現(xiàn)

9、ⅣIg可上調(diào)抑制性FcγRⅡb活性并下調(diào)激活性FcγRⅡa活性?？诜髣┝康厝姿?HD-DXM)沖擊療法是當前皮質(zhì)激素治療ITP的研究熱點，其療效逐漸得到了廣泛認可，尤其是治療初治ITP患者。最近ITP國際工作組已將HD-DXM作為初診ITP的標準一線療法，但其療效的具體機制尚不明確。初步研究證實：它可抑制抗體生成及減輕抗原抗體反應(yīng)、改善毛細血管通透性、刺激骨髓造血及血小板向外周血的釋放、恢復Th1/Th2平衡、增加Tregs數(shù)量等。

10、迄今為止，尚未有系統(tǒng)的關(guān)于ITP患者與健康對照外周單核及B細胞上FcγRs表達及HD-DXM對ITP患者Fcγ受體系統(tǒng)影響的報道。
　　 目的：檢測初診活動性ITP患者及健康對照外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達；研究HD-DXM治療后ⅡP患者FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表達變化、FcγRⅡa/Ⅱb mRNA及蛋白表達變化：檢測ITP患者治療前后單核/巨噬細

11、胞對致敏自身血小板吞噬能力變化及Th1/Th2細胞因子平衡變化；體外檢測ITP患者單核細胞在DXM存在情況下培養(yǎng)時FcγRⅡa/Ⅱb mRNA表達變化，探討HD-DXM影響FcγRs系統(tǒng)變化的可能機制。
　　 材料和方法：
　　 (1)外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達及FcγRⅡ的亞型Ⅱa及Ⅱb mRNA及蛋白表達檢測部分，抽取23例初診活動性ITP患者治療前、治療后2周及20例健康對照的外周血，分離

12、血漿及單個核細胞。
　　 (2)流式細胞儀染色法測定外周血FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ的表面分子表達；免疫磁珠陽性分選外周血CD14+單核細胞；實時定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測單核細胞FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達；免疫沉淀(IP)和western blotting檢測FcγRⅡa、Ⅱb的蛋白表達；酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)檢測ITP治療前后及正常對照血漿中IFN-γ、IL-4的水平。
　　 (3)體外

13、實驗部分抽取14例治療前ITP患者外周血做細胞培養(yǎng)。免疫磁珠陽性分選外周血CD14+單核細胞，加入不同劑量的DXM培養(yǎng)16h，real-timeRT-PCR檢測FcγRⅡa、Ⅱb的mRNA表達變化。
　　 (4)抽取10例健康對照、10例ITP患者治療前及治療2周后外周血，貼壁法分離外周血單核細胞并刺激，與CMFDA(5-chloromethylfluorescein diacetate)探針標記過的致敏自身血小板在37℃或4℃

14、共培養(yǎng)，流式細胞儀檢測血小板被自身單核/巨噬細胞吞噬情況，應(yīng)用MFI37℃/MFI4℃做為吞噬指數(shù)以判定吞噬能力。
　　 結(jié)果：
　　 (1)流式測定的FcγRⅠ、Ⅱ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ表面分子表達高低以平均熒光強度表示(MFI)，結(jié)果顯示：①初診ITP患者單核細胞表面分子FcγRⅠ表達(504.6±58.6)顯著高于正常對照；經(jīng)HD-DXM治療后2周，F(xiàn)cγRⅠ表達較治療前顯著降低；FcγRⅠ在治療后與正常對照組無顯著差

15、異。②單核細胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)、Ⅲ在ITP組治療前(FcγRⅡ82.6±160；FcγRⅢ9.9±4.6)、治療后(FcγRⅡ75.4±18.9；FcγRⅢ8.9±3.0)及正常對照組(FcγRⅡ83.2±16.3；FcγRⅢ9.3±3.2)之間無顯著差異(FcγRⅡ P=0.947；FcγRⅢ P=0.694；ANOVA)。③B細胞表面分子FcγRⅡ(Ⅱa+Ⅱb)在ITP組治療前(82.3±13.0)、治療后(82.7

16、±11.8)及正常對照組(83.2±12.1)之間差異無顯著性。
　　 (2)單核細胞FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA和蛋白表達：①real-time RT-PCR結(jié)果：應(yīng)用FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA的比率變化表示HD-DXM對FcγRⅡa和FcγRⅡb mRNA表達的影響。初診ITP患者FcγRⅡa/Ⅱb mRNA的比率值為5.88±5.12，與正常對照組存在顯著差異；接受HD-DXM治療后FcγRⅡa/Ⅱb m

17、RNA的比率值(0.61±0.86)較治療前顯著降低。②western blotting結(jié)果：應(yīng)用相對光密度值高低來代表FcγRⅡa和FcγRⅡb蛋白表達量。初診ITP患者單核細胞FcγRⅡa表達量接受HD-DXM治療后顯著降低，并伴有FcγRⅡb的顯著升高。
　　 (3)ITP患者HD-DXM治療后單核/巨噬細胞FcγR介導的吞噬致敏血小板能力的改變。應(yīng)用CMFDA做探針標記血小板，初診ITP患者吞噬指數(shù)為(MFIratio：

18、3.5±0.7)，顯著高于正常對照。HD-DXM治療后吞噬指數(shù)降為(MFI ratio：2.6±1.0)，較治療前有顯著差異。
　　 (4)ITP患者治療前后血漿IFN-γ、IL-4水平變化。初診ITP患者治療前Th1系列細胞因子IFN-γ較正常對照顯著增高和IL-4的顯著降低。HD-DXM治療后，IFN-γ水平較治療前顯著降低并伴有IL-4的顯著升高。
　　 (5)DXM對ITP患者體外培養(yǎng)單核細胞FcγRⅡa、Ⅱb

19、mRNA表達的影響。體外培養(yǎng)ITP患者的單核細胞在加入DXM后出現(xiàn)FcγRⅡa、Ⅱb mRNA表達的同時上調(diào)，這種效應(yīng)在DXM為1μM時最明顯。在DXM為0.5μM和1μM時，F(xiàn)cγRⅡb mRNA表達上調(diào)的幅度要高于FcγRⅡa的幅度。
　　 結(jié)論：
　　 (1)初診活動性ITP患者外周血單核細胞呈現(xiàn)活化性FcγRⅠ、FcγRⅡa的表達升高，及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達降低；
　　 (2)ITP患者

20、經(jīng)HD-DXM治療后2周，單核細胞出現(xiàn)活化性FcγRⅠ、FcγRⅡa的表達降低，及抑制性FcγRⅡb mRNA及蛋白表達升高，F(xiàn)cγRⅡa/Ⅱb mRNA比率恢復正常；
　　 (3)ITP患者治療后伴隨著單核細胞活化性和抑制性FcγRs受體平衡恢復，單核/巨噬細胞FcγR介導的自體致敏血小板吞噬能力降低；
　　 (4)ITP患者呈現(xiàn)Th1細胞極化狀態(tài)，經(jīng)HD-DXM治療后，Th1/Th2失衡狀態(tài)得到糾正；