Blcap和Nnat在小鼠發(fā)育中的表達及其調(diào)控機制研究.pdf

1、印記基因Bladder Cancer-Associated Protein(Blcap)和Neuronatin(Nnat)位于小鼠2號染色體末端。Blcap為父本印記母本表達，Nnat為母本印記父本表達，且位于基因Blcap長為8.5kb的內(nèi)含子中。之前的研究發(fā)現(xiàn)，Blcap和Nnat在轉錄本水平可能存在相互作用，但未詳細闡明。此外，相關研究推測，位于NNAT第一外顯子上游1.5kb的三個潛在CTCF結合位點的低甲基化與NNAT及BLC

2、AP_V2a在腎母細胞瘤組織中的高表達水平有一定關系。因此，本文以Blcap和Nnat為研究對象，分析了二者在小鼠胚胎發(fā)育中的表達模式，轉錄水平的相互影響以及CTCF在其表達調(diào)控中的作用。
　　首先，我們利用原位雜交及定量PCR技術系統(tǒng)的分析了Blcap及Nnat在小鼠發(fā)育過程中的表達模式。定量結果顯示，Blcap和Nnat的表達水平從E9.5至E13天左右一直呈現(xiàn)上升趨勢，并分別在E12.5和E13.5天達到最高。此后隨著發(fā)育階

3、段的進行，到E18.5天過程中兩基因表達水平都出現(xiàn)了不同程度的下降。通過分析定量PCR及RNA-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，與其他組織相比，Blcap和Nnat在E14.5, E15.5天及成體小鼠中腦組織中高表達。原位雜交結果也顯示，Blcap和Nnat在E9.5, E11.5和E15.5天胚胎主要表達于前腦泡、中腦泡、菱腦泡及間腦等中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，并且在這些神經(jīng)發(fā)育的關鍵時期中，Nnat的表達較Blcap更廣泛、更豐富，特別是Nnat在體節(jié)、前

4、肢、后肢及垂體中都有表達信號。腦不同發(fā)育時期的定量結果顯示，從 E15.5至 P30天，Blcap在腦組織中的表達逐漸升高，但Nnat表達明顯下降。之后，我們通過腦切片原位雜交實驗進一步研究了Blcap和Nnat在出生后隨小鼠腦發(fā)育過程的表達變化情況。結果顯示，Blcap和Nnat都普遍表達于新出生小鼠腦組織(P0)。而從 P10到P30天過程中，Blcap的信號特異表達于小腦、海馬。隨后，Blcap的表達水平出現(xiàn)了下降，但在成體小腦的

5、內(nèi)顆粒細胞層、嗅球及海馬中都有明顯的信號。然而，不同于Blcap的表達模式，Nnat的轉錄本仍然存在于P10天小鼠整個腦組織中，但從P10至成體發(fā)育過程中，Nnat表達出現(xiàn)了明顯下調(diào)，并只在小腦和嗅球中少量表達。這些結果提示Blcap和Nnat在神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)育中起到重要的作用，特別是與小腦、嗅球及海馬的發(fā)育成熟及功能有密切關系。
　　其次，為了初步研究Blcap和Nnat的相互調(diào)控，我們設計了靶向這對印記基因的siRNA，并構建了

6、Blcap和Nnat的過表達載體，轉染 N2a或 NIH-3T3細胞系。結果顯示，干擾或過表達Nnat轉錄本后，Blcap的表達水平并未發(fā)生變化，同樣，干擾或過表達Blcap后，Nnat的表達水平也未發(fā)生變化。這些結果表明說明在轉錄水平Blcap和Nnat不存在相互調(diào)控。
　　最后，我們構建了靶向敲除Nnat第一外顯子上游的三個潛在CTCF結合位點（CTCFBS＃1～CTCFBS＃3）的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，以此來研究此區(qū)域

7、是否作為一個可以同時調(diào)節(jié)Blcap和Nnat的印記調(diào)節(jié)區(qū)存在。研究結果顯示，在敲除此區(qū)域后，Nnat表達出現(xiàn)上調(diào)，但是Blcap未發(fā)生明顯變化，這說明在小鼠中，此CTCF結合區(qū)域可能參與Nnat的表達調(diào)控，但并不影響B(tài)lcap表達。
　　綜上所述，本研究分析了Blcap和Nnat在小鼠胚胎及出生后發(fā)育過程中的表達譜。初步證明了Blcap和Nnat在轉錄水平并不存在相互影響，報道了一個潛在的影響Nnat表達的調(diào)控區(qū)域。為后續(xù)Blca