低氧-HIFα通路在小鼠骨發(fā)育中的作用及其調(diào)控機(jī)制.pdf

1、哺乳動(dòng)物骨骼系統(tǒng)主要有三種起源，即軸旁中胚層，側(cè)中胚層及神經(jīng)嵴，而依據(jù)成骨方式又可分為：膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨。骨發(fā)育規(guī)律而有序的過程依賴一系列生長(zhǎng)因子、生物分子及信號(hào)傳導(dǎo)通路的精密而準(zhǔn)確調(diào)控。 低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factors，HIFs)包括三種亞型(HIF-1，HIF-2和HIF-3)，目前的研究主要集中于HIF-1及其氧感應(yīng)元件HIF-1α。低氧誘導(dǎo)因子-1是低氧條件下調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的核心

2、轉(zhuǎn)錄因子，自1992年首次被發(fā)現(xiàn)以來一直為生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。HIF-1α在常氧條件下極不穩(wěn)定，氧依賴降解結(jié)構(gòu)域的脯氨酸發(fā)生羥化，與pVHL(proteinVon Hippel-Lindau)結(jié)合而被蛋白酶體降解。低或缺氧時(shí)，HIF-1α聚積并轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞核內(nèi)與HIF-1β形成聚合體，激活HIF-1敏感的靶基因進(jìn)而引起組織細(xì)胞一系列的耐氧適應(yīng)性反應(yīng)。鑒于骨發(fā)育過程中存在明顯低氧狀態(tài)，探索HIF-1在骨發(fā)育過程中的調(diào)控機(jī)制，篩查和分析與其

3、相關(guān)的調(diào)控基因和分子靶標(biāo)，將有助于提高對(duì)骨關(guān)節(jié)發(fā)生發(fā)育的認(rèn)識(shí)、提出骨與關(guān)節(jié)病損防治、監(jiān)控和預(yù)測(cè)開辟新的措施。 目的：分別在不同細(xì)胞水平敲除HIF-1α及其降解識(shí)別-VHL，深入探討HIF-1α在骨發(fā)育各個(gè)階段的作用及其調(diào)控機(jī)制。 方法： (一)在間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除HIF-1α 1、帶有Dermol啟動(dòng)子的Cre重組酶的C57/BL6小鼠與HIF-1αflox/floxC57/BL6小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(De

4、rmol-Cre+/- HIF-1αflox/flox)與對(duì)照組小鼠(Dermol-Cre-/-HIF-1αflox/flox)。 2、分別取敲除組與對(duì)照組胚胎13.5天至P0(新生小鼠)，行組織化學(xué)染色、免疫組織化學(xué)染色等觀察體內(nèi)間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除HIF-1α后對(duì)骨發(fā)育的影響。 3、取胚胎12.5天HIF-1αflox/flox C57/BL6顱蓋骨，培養(yǎng)間充質(zhì)前體細(xì)胞。體外應(yīng)用Adeno-GFP(對(duì)照組)和Adeno

5、-Cre(實(shí)驗(yàn)組)感染，行實(shí)時(shí)定量熒光PCR、von Kossa和堿性磷酸酶染色、增殖和凋亡檢測(cè)、染色體免疫共沉淀等觀察體外間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除HIF-1α后對(duì)骨發(fā)育的影響。 (二)在成骨細(xì)胞水平敲除HIF-1α及VHL 1、帶有骨鈣素(OC)啟動(dòng)子的Cre重組酶的FVB小鼠與HIF-1αflox/floxC57/BL6小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(OC-Cre+/- HIF-1αflox/flox)與對(duì)照組小鼠(OC-Cre-/-

6、HIF-1αflox/flox)；帶有骨鈣素(OC)啟動(dòng)子的Cre重組酶的FVB小鼠與VHLflox/flox FVB小鼠雜交產(chǎn)生敲除組(OC-Cre+/-VHLflox/flox)。與對(duì)照組小鼠(OC-Cre-/-VHLflox/flox)。 2、分別取敲除組與對(duì)照組胚胎14.5天(E14.5)至18.5天(E18.5)及出生后6.5天(N6.5)至9.5天(N9.5)，解剖顯微鏡下觀察HIF-1α敲除后，對(duì)肢體初級(jí)和次級(jí)骨化

7、中心和椎體發(fā)育的影響。 3、分別取敲除組與對(duì)照組4、8、12周齡肢體和椎體，行組織化學(xué)染色、X線、Micro CT、骨小梁面積測(cè)量、鈣元素含量、四環(huán)素?zé)晒怆p標(biāo)記、實(shí)時(shí)定量熒光PCR及Western blotting等觀察HIF-1α及VHL對(duì)骨發(fā)育的影響。 結(jié)果：(一)在間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除HIF-α 1、在間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除HIF-1α后，胚胎13.5天至P0(新生小鼠)小鼠較對(duì)照組體積減小，發(fā)育遲緩。

8、2、體外間充質(zhì)前體細(xì)胞敲除HIF-1α后，細(xì)胞分化減少而增生增加，骨形成特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2和Osx表達(dá)降低，HIF-2α表達(dá)升高。 (二)在成骨細(xì)胞水平敲除HIF-1α及VHL 1、在成骨細(xì)胞水平敲除HIF-1α后，敲除組與對(duì)照組肢體初級(jí)和次級(jí)骨化中心和椎體發(fā)育未見明顯差異。 2、在成骨細(xì)胞水平敲除HIF-1α后，敲除組軟骨內(nèi)成骨較對(duì)照組血管形成減少，新骨形成速度減慢，骨量減少，膜內(nèi)成骨未見明顯影響；敲除V

9、HL后，敲除組軟骨內(nèi)成骨較對(duì)照組血管形成增多，新骨形成速度加快，骨量增加，膜內(nèi)成骨未見明顯影響。 結(jié)論： 1、HIF-1α在間充質(zhì)細(xì)胞水平敲除導(dǎo)致膜內(nèi)化骨和軟骨內(nèi)化骨過程延遲；低氧/HIFα信號(hào)通路通過刺激Osx的表達(dá)而促進(jìn)間充質(zhì)細(xì)胞分化。 2、HIF-1α在成骨細(xì)胞水平對(duì)軟骨內(nèi)化骨過程的初級(jí)和次級(jí)骨化中心發(fā)育未見影響；VHL/HIF-1α信號(hào)通路在成骨細(xì)胞水平通過調(diào)控血管形成而最終影響軟骨內(nèi)成骨過程，但對(duì)膜內(nèi)成