成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin對(duì)小鼠骨量和骨生長(zhǎng)的調(diào)控作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　骨質(zhì)疏松是以骨量減少、骨的顯微結(jié)構(gòu)受損、骨脆性增加,從而導(dǎo)致骨折危險(xiǎn)性升高為特征的疾病,其發(fā)病率隨年齡增加而升高,嚴(yán)重威脅人類健康,其防治對(duì)提高人民生活質(zhì)量和減輕社會(huì)及家庭經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)意義重大。目前,治療骨質(zhì)疏松的常用藥物有雙磷酸鹽、降鈣素、甲狀旁腺素等。各種藥物均顯示了一定的療效,但容易引起臟器功能障礙和繼發(fā)性骨形成減少等副作用[1]。
　　Wnt/β-catenin信號(hào)通路被證實(shí)在調(diào)控骨量中具有重要作用

2、,新近發(fā)現(xiàn),針對(duì)這個(gè)通路研制出的藥物比其他藥物具有增加骨量更明顯的優(yōu)點(diǎn),顯示了良好的臨床應(yīng)用前景。但其安全性能尚未得到充分證實(shí),其作用機(jī)制尚存在很多爭(zhēng)議[2]。骨形成和骨吸收二者之間的平衡決定骨的總量:成骨細(xì)胞分泌骨基質(zhì),增加骨量;而破骨細(xì)胞進(jìn)行骨吸收,兩者協(xié)同作用調(diào)控骨量。目前大量的研究證實(shí)Wnt/-catenin信號(hào)通路在調(diào)控骨量中具有重要作用:條件敲除β-catenin或Wnt輔受體Lrp6/Lrp5后,小鼠骨量明顯下降;相反,在

3、成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-Catentin可顯著增加骨量。但激活Wnt/β-Catentin信號(hào)通路活增加骨量的機(jī)制尚不明了,對(duì)成骨和破骨的作用效應(yīng)尚存很大的爭(zhēng)議:Holmen和Kramer等人認(rèn)為β-catentin主要通過調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞數(shù)量和功能調(diào)控骨量,而對(duì)成骨形成沒有影響[3,4];Cawthorn和Riddle等人認(rèn)為Wnt/β-Catentin主要通過促進(jìn)骨形成增加骨量,對(duì)骨吸收沒有明顯影響[5,6];而Chen等人證實(shí)β-Cat

4、entin同時(shí)通過調(diào)節(jié)骨形成和骨吸收來控制骨量[7]。
　　本研究中,我們以Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠雜交,通過在出生后不同時(shí)期注射他莫昔芬(Tamoxifen,TM)在成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin,觀察不同時(shí)期激活β-catenin后對(duì)小鼠骨量和骨生長(zhǎng)的影響,并初步探討其機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)方法:
　　第一部分:成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-ca

5、tenin對(duì)小鼠骨量的調(diào)控作用及機(jī)制
　　將Catnb+/lox(exon3)小鼠和3.2kb pro-collagen I Cre-ERTM小鼠雜交,基因型鑒定篩選CA-β-catenin小鼠作為實(shí)驗(yàn)鼠,而同窩野生組小鼠作為對(duì)照小鼠。在出生后第3日,2、4、5、7月等時(shí)相點(diǎn)注射TM,持續(xù)1月,以持續(xù)激活β-catenin。
　　1.觀察小鼠外形,測(cè)量小鼠身長(zhǎng)等大體指標(biāo);
　　2.X線片和Micro-CT檢測(cè)小鼠出生后

6、不同時(shí)期腰椎、脛骨骨密度、骨量和骨組織結(jié)構(gòu)的變化;
　　3.HE染色和Safranin O染色觀察小鼠脊椎和長(zhǎng)骨顯微形態(tài)學(xué)變化;
　　4.TRAP染色破骨細(xì)胞數(shù)量;
　　5.免疫組織化學(xué)染色觀察成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞、骨形成、骨吸收等相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化情況,包括骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP), Runx2轉(zhuǎn)錄因子(runt-related transcription factor 2,Ru

7、nx2),組織非特異性堿性磷酸酶(nonspecific alkaline phosphatase,TNAP);
　　6.定量PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞分化、破骨細(xì)胞、骨形成、骨吸收等相關(guān)標(biāo)記物的表達(dá)變化情況,包括TNAP,Runx2,BSP,抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate Resistant Acid Phosphatase,TRAP),核因子κB受體活化因子配體(Receptor Activator for Nuclear Fa

8、ctor-κB Ligand,RANKL):骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin,OPG)比值;
　　7.ELISA檢測(cè)骨形成和骨吸收相關(guān)標(biāo)記物,包括Ⅰ型膠原蛋白氨基端前膠原肽(N-terminal peptide of typeⅠprocollagen, PINP),骨鈣素(osteocalcin,OC),Ⅰ型膠原交聯(lián)c端肽(C-terminal telopeptide of type I collagen,CTX-I)和

9、抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate resistant acid phosphatase5b,TRAcP5b)。
　　第二部分:成骨細(xì)胞中持續(xù)激活β-catenin對(duì)小鼠骨生長(zhǎng)的影響及可能機(jī)制
　　1.小鼠模型同上;
　　2.X線片檢測(cè)小鼠出生后不同時(shí)期小鼠身長(zhǎng)的變化;
　　3.HE染色和Safranin O染色觀察小鼠脊椎和長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板變化情況;
　　4.收集小鼠血清,測(cè)量血磷、血鈣等的水平;

10、　　5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)骨生長(zhǎng)相關(guān)因子FGF23(Fibroblast growth factor23,FGF23)等的變化情況;
　　6.TUNEL法檢測(cè)椎體生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞凋亡。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　1.從早期(3天)和晚期(2、4、5、7月)持續(xù)激活β-catenin均可增加松質(zhì)骨骨量。Micro-CT顯示,早期激活時(shí),小鼠脊椎松質(zhì)骨骨量增加可達(dá)300％,但增加的骨量靠近生長(zhǎng)板一側(cè);而從2、4、5、7月開始激活,小

11、鼠松質(zhì)骨骨量增加也可達(dá)到180—200%,增加的骨量分布整個(gè)椎體;
　　2.從早期(3天)和晚期(2、4、5、7月)持續(xù)激活β-catenin后成骨細(xì)胞分化標(biāo)記物RUNX2、BSP表達(dá)上調(diào),骨形成標(biāo)記物TNAP表達(dá)增加;同時(shí),破骨細(xì)胞標(biāo)記物RANKL、TRAP表達(dá)下調(diào)。ELISA提示血清PINP、OC濃度升高,CTX-I、TRAcP5b濃度降低。這些共同提示骨形成增加,骨吸收減少;
　　3.早期開始激活β-catenin雖然

12、可以增加骨量,但小鼠發(fā)育受到影響,表現(xiàn)為體型變小、長(zhǎng)骨和椎體變短。HE染色和Safranin O染色顯示小鼠生長(zhǎng)板變長(zhǎng),尤其是肥大層細(xì)胞明顯增多,凋亡減少。而晚期激活β-catenin后骨生長(zhǎng)未受明顯影響;
　　4.早期持續(xù)激活β-catenin,小鼠血磷水平降低,血鈣水平無明顯變化,FGF23表達(dá)上調(diào),這可能是小鼠骨生長(zhǎng)受阻的原因。晚期血磷水平降低,血鈣水平和FGF23表達(dá)未見差異。
　　結(jié)論:
　　從早期(3天)和