CGRP對Pg-LPS誘導的成骨細胞損傷的調(diào)控作用和機制研究.pdf

1、牙周?。≒eriodontal disease）是指發(fā)生在牙周支持組織的疾病。牙周組織（包括牙齦、牙周膜、牙槽骨、牙骨質(zhì)）在機體內(nèi)外因素等影響下發(fā)生的改變，例如：牙槽骨破壞性吸收，牙周膜充血、水腫、溶解、蛻變，牙骨質(zhì)沉積受阻，牙齒松動，真性牙周袋形成，牙齦炎癥、增生、萎縮等統(tǒng)稱為牙周病。其中牙槽骨按解剖部份分為固有牙槽骨、密質(zhì)骨、松質(zhì)骨。
　　牙槽骨的破壞性吸收是由于骨重建過程中牙槽骨病理或（和）生理的不平衡引起，是牙周病的主要特

2、征之一。成骨細胞和破骨細胞的數(shù)量和比例決定骨組織的重建；同時，炎癥因子、細胞活性、細胞凋亡、細胞生命周期性調(diào)節(jié)等都在骨組織重建過程中起著相當重要的作用。在眾多炎癥因子中腫瘤壞死因子就是其中研究的較詳盡的一組。腫瘤壞死因子家族成員中的腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是與細胞凋亡關系最為密切的是腫瘤壞死因子，它參與多種細胞的凋亡調(diào)控。在局部病損的組織內(nèi)有高濃度的腫瘤壞死因子-α聚集，TNF-α及其受體在骨吸收過程中起著重要的作用，影響細胞凋亡

3、。
　　牙周炎發(fā)生、進展、代謝的整個過程均有成骨細胞參與。牙菌斑（dental plaque）是牙周炎的始動因素。齦上菌斑和齦下菌斑包含大量的致病菌，其中革蘭氏陰性厭氧菌是侵蝕性最強的一類。革蘭氏陰性細菌細胞壁外膜上的主要成分是脂多糖（LPS），具有破壞牙槽骨組織、促使牙周炎發(fā)展和惡化的作用。LPS可直接作用于牙周靶細胞，抑制牙周靶細胞的增殖和分化，加速牙周組織的吸收。鑒于上述原因，脂多糖在增加牙周炎發(fā)病率和促進牙槽骨吸收這一方面

4、的特性也成為牙周病病因?qū)W研究的熱點。研究證實，脂多糖和牙周炎病原體的代謝產(chǎn)物可以影響骨基質(zhì)的形成和細胞凋亡，在這一過程中，成骨細胞的生物學效應尤其重要。牙槽骨的吸收或者骨質(zhì)疏松是由于脂多糖引起的炎癥反應和成骨細胞凋亡異常，從而導致骨吸收和骨形成之間的紊亂引起?，F(xiàn)階段尚無有效治療由LPS誘導的骨破壞的藥物。預防牙槽骨吸收和骨質(zhì)流失的主要目的是探討成骨細胞的保護功能和活動的不平衡狀態(tài)，尋找潛在的藥物治療靶點。
　　降鈣素相關基因肽（C

5、GRP）是1971年首次從甲狀腺髓樣癌組織中提取的蛋白。CGRP由37個氨基酸組成，包括a-cgrp及b-cgrp兩個異構(gòu)體，最初是在感覺神經(jīng)末梢被發(fā)現(xiàn)，以分泌顆粒的形式儲存。隨著研究的深入，近年來發(fā)現(xiàn)它存在于神經(jīng)系統(tǒng)中，同時發(fā)現(xiàn)在骨組織、呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等組織中均有CGRP的分布。CGRP在各種組織中呈現(xiàn)出多元生理學效應，還可控制相關的免疫應答。骨組織中CGRP的來源不僅僅是由感覺神經(jīng)纖維末梢分泌，而且可以由成骨細胞以自

6、分泌和旁分泌的形式生成，體外實驗已經(jīng)證實CGRP可促進成骨細胞的增殖、分化、增加細胞體積，同時在成骨細胞的表面發(fā)現(xiàn)有CGRP受體的存在。研究發(fā)現(xiàn)，CGRP作為神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的交叉點，在炎癥中還具有潛在的調(diào)節(jié)作用，它不僅能夠直接通過影響CD4+Thelper細胞，也可以通過影響抗原遞呈細胞的功能調(diào)節(jié)適應性免疫反應。此外，CGRP還能夠有效的抑制單核巨噬細胞和樹突細胞釋放炎癥因子如TNF-α，IL-1β和CCl4。大量研究提示，讓我們比

7、較確定的是，CGRP作為一個潛在炎癥調(diào)控者，可以抑制促炎因子的釋放，且在炎癥過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，但是對于LPS誘導的成骨細胞損傷的調(diào)控機制，還不是十分清楚。
　　在本次研究中，通過體外實驗觀察到牙齦卟啉單胞菌脂多糖（Pg-LPS）可以抑制成骨細胞活性并誘導成骨細胞凋亡；外源性地加入CGRP后，可以減弱這一作用。因此，本實驗旨在探討 Pg-LPS對成骨細胞的損傷作用以及 CGRP對這一過程的調(diào)控作用，進一步探討炎癥因子的調(diào)節(jié)機

8、制，為牙周病的病因?qū)W研究提供理論基礎。
　　方法：
　　（一）成骨細胞的原代培養(yǎng):選新生小鼠顱骨采用組織塊培養(yǎng)法獲取細胞。組織塊消化后棄上清，收集組織塊和游出的細胞，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)基，放致5％CO2孵箱中37℃培養(yǎng)。
　?。ǘ┘毎麄鞔囵B(yǎng):待細胞消化到開始收縮脫壁后轉(zhuǎn)移致新的培養(yǎng)瓶進行細胞傳代實驗。本實驗所采用的成骨細胞均是傳至第3-4代的。細胞實驗前均用無血清的培養(yǎng)液替換之前的含血清的培養(yǎng)液。孵箱中再繼續(xù)培養(yǎng)成骨細胞24

9、小時，其目的是使實驗細胞均處在G0期。
　　（三）成骨細胞鑒定實驗:組織塊法培養(yǎng)的細胞都經(jīng)相差顯微鏡行細胞形態(tài)學觀察鑒定后再用堿性磷酸酶（ ALP）染色法鑒定，再行下一步細胞實驗。
　?。ㄋ模㏄g-LPS抑制成骨細胞活性并誘導成骨細胞凋亡
　　1、Pg-LPS抑制成骨細胞活性的實驗研究：實驗一：以濃度分別為0、25、50、100、500、1000ng/mLPg-LPS進行實驗，作用48h后收集細胞進行檢測；實驗二：用濃

10、度為500ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細胞，在不同時間點：0、6、12、24、48、72h后收集細胞進行細胞實驗。兩組均采用CCK8法檢測Pg-LPS對成骨細胞的活性影響。
　　2、Pg-LPS誘導成骨細胞凋亡的實驗研究：該實驗的分組情況同上述CCK8實驗。用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測盒檢測Pg-LPS對成骨細胞凋亡的影響。
　?。ㄎ澹〤GRP對Pg-LPS抑制成骨細胞活性及誘導凋亡的調(diào)控作用

11、　　1、Pg-LPS對CGRP表達的影響： Pg-LPS作用于成骨細胞后分別于0、6、12、24、48h收集細胞進行實驗。檢測Pg-LPS對成骨細胞CGRP含量的影響。
　　2、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞活性的影響：外源性地加入濃度0、1、10、100、1000nM的 CGRP，對同一濃度（500ng/ml）Pg-LPS作用后的成骨細胞進行檢測。用CCK8法檢測CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞的活性影響。
　　3

12、、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞凋亡的影響：實驗共4組：對照組、Pg-LPS組、CGRP組、CGRP+Pg-LPS組進行實驗檢測，用Annexin V-FITC/PI細胞凋亡試劑盒流式細胞學檢測CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞的凋亡影響。
　　4、凋亡因子檢測CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞活性的調(diào)控：上述細胞共培養(yǎng)48h后進行選用Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase3抗體，運用蛋白免疫印跡

13、法檢測相關凋亡蛋白。
　　（六）CGRP對Pg-LPS誘導成骨細胞凋亡過程中TNF-?的表達影響
　　1、Pg-LPS對成骨細胞炎癥因子的影響：在成骨細胞中加入500 ng/mL Pg-LPS后于0、6、12、24、48h時終止細胞培養(yǎng)，用炎癥因子試劑盒檢測上清液中 Pg-LPS對成骨細胞炎癥因子（TNF-?、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的影響。
　　2、CGRP對 Pg-LPS作用下的成骨細胞炎癥因

14、子的影響：實驗分為對照組和Pg-LPS、CGRP、Pg-LPS+CGRP3個實驗組，其中 Pg-LPS+CGRP組成骨細胞先用100 nM CGRP作用30min后在加入500 ng/mL Pg-LPS作用48h后終止培養(yǎng)，用炎癥因子試劑盒檢測上清液中 CGRP對 Pg-LPS作用下的成骨細胞炎癥因子（TNF-?、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的影響。
　　3、CGRP對 Pg-LPS作用下成骨細胞腫瘤壞死因子的影

15、響：實驗分為對照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS3個實驗組，檢測CGRP對Pg-LPS作用下的成骨細胞后TNF-α的影響。
　　（七）TNF-α在Pg-LPS抑制成骨細胞活性及誘導凋亡中的作用
　　1、TNF-α及CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞的活性的影響：實驗分組：對照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α，分別作用于成骨細胞后用CCK8法檢測對成骨細胞活性的影響。

16、
　　2、TNF-α及CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞凋亡的影響：實驗分組：對照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS、CGRP+Pg-LPS+TNF-α，分別作用于成骨細胞后用 Annexin V-FITC/PI法檢測對成骨細胞凋亡的影響。
　　3、凋亡因子檢測TNF-α及CGRP對Pg-LPS作用下成骨細胞的活性的影響：實驗分組：對照組、CGRP、CGRP+Pg-LPS實驗組，收集細胞后運用Cleaved-Caspas

17、e8、Cleaved-Caspase3抗體進行蛋白免疫印跡實驗。檢測TNF-α的表達。
　　結(jié)果：
　?。ㄒ唬┰晒羌毎男螒B(tài)學觀察。小鼠顱骨的細小組織塊培養(yǎng)24h后，鏡下觀察：組織塊附近可觀察到少數(shù)細胞游出；繼續(xù)培養(yǎng)24h后鏡下觀察：已有部分細胞開始貼壁，且周圍發(fā)亮，顯示其具有活性。以組織塊為中心，細胞分布密集處呈鋪路石狀，胞體膨大，部分細胞胞漿豐富，胞漿伸長，核偏位，突起細長呈平行樣或相嵌狀排列。細胞形狀不規(guī)則，多呈三

18、角形及多角形，也有長梭形。
　　（二）ALP法鑒定原代培養(yǎng)細胞。采用堿性磷酸酶（ALP）染色所培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)的染色細胞，呈塊狀或灰黑色顆粒狀沉淀，胞質(zhì)為陽性反應。
　　（三）Pg-LPS抑制成骨細胞活性并誘導成骨細胞凋亡
　　1、Pg-LPS對成骨細胞活性的影響：用不同濃度的 Pg-LPS作用于成骨細胞并在48h時檢測細胞活性，發(fā)現(xiàn)當Pg-LPS在濃度為50 ng/mL時活性開始降低，并且在濃度為100 ng/mL、5

19、00 ng/mL、1000 ng/mL時顯著降低了成骨細胞的活性；用濃度500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細胞后，在0、6、12、24、48、72h這6個不同時間點收集成骨細胞進行的實驗結(jié)果顯示：隨著作用時間的遞增，成骨細胞的活動明顯降低。
　　2、Pg-LPS對成骨細胞凋亡的影響：不同濃度的Pg-LPS作用于成骨細胞并在48h時檢測成骨細胞凋亡率，發(fā)現(xiàn)Pg-LPS濃度在50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/m

20、L、1000 ng/mL時成骨細胞凋亡率明顯遞增，濃度在達到500 ng/mL后遞增的趨勢減緩趨于平衡；用濃度為500 ng/mL的Pg-LPS刺激成骨細胞后在不同的時間點檢測成骨細胞凋亡率，結(jié)果顯示成骨細胞的凋亡率隨著作用時間的增加呈現(xiàn)明顯遞增趨勢，細胞凋亡率與Pg-LPS處理的時間呈正相關性，并且在48h時趨于平衡。
　　（四）CGRP對Pg-LPS抑制成骨細胞活性及誘導成骨細胞凋亡的調(diào)控作用
　　1、Pg-LPS對 C

21、GRP的調(diào)控：Pg-LPS作用于成骨細胞后分別于0、6、12、24、48收集細胞進行實驗，最后對 CGRP含量數(shù)據(jù)分析。結(jié)果顯示：CGRP的表達在6h時出現(xiàn)短暫升高，此后，蛋白質(zhì)含量逐漸降低，并且隨著作用時間的遞增，CGRP含量明顯下降。
　　2、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞的活性抑制：用不同濃度的CGRP對相同濃度（500ng/ml）Pg- LPS作用下的成骨細胞進行實驗。結(jié)果顯示：CGRP對Pg-LPS有一定的調(diào)控作用，

22、當CGRP的濃度為100nM時，CGRP能顯著減輕Pg-LPS對成骨細胞活性的抑制。
　　3、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞凋亡的誘導：本實驗用對照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS共四個組分別處理成骨細胞后用流式細胞儀檢測細胞的凋亡，結(jié)果顯示100nM的CGRP能夠顯著減弱Pg-LPS誘導的成骨細胞的凋亡率。這一結(jié)果與之前的實驗結(jié)果是一致的。
　　4、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞的活性的抑制：本實

23、驗用對照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS四組，作用于成骨細胞后，運用Cleaved-Caspase8、Cleaved-Caspase3抗體檢測細胞凋亡，結(jié)果顯示：CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞的活性的抑制。
　　（五）CGRP對Pg-LPS誘導成骨細胞凋亡過程中TNF-?的表達影響
　　1、Pg-LPS誘導成骨細胞炎癥因子的表達：實驗分別在0、6、12、24、48h5個時間點收集細胞，檢測TNF-α、I

24、L-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2炎癥因子的表達。結(jié)果顯示：與對照組比較Pg-LPS促進TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1和MCP-2的表達，并且呈時間依賴性表達。
　　2、CGRP抑制Pg-LPS對的成骨細胞炎癥因子的誘導：本實驗檢測對照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨細胞后，細胞炎癥因子（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2）的表達。結(jié)果顯示：相同濃度的CGRP

25、作用后只有對TNF-α的生成具有顯著的變化，而對IL-1β、IL-6、MCP-1、MCP-2沒有明顯變化。
　　3、CGRP抑制Pg-LPS對成骨細胞TNF-α的誘導：實驗將對照組、Pg-LPS、CGRP、CGRP+Pg-LPS作用于成骨細胞后細胞炎癥因子 TNF-α表達。結(jié)果顯示：CGRP抑制Pg-LPS對的成骨細胞TNF-α的誘導。
　?。㏕NF-α在Pg-LPS抑制成骨細胞活性及誘導凋亡中的作用
　　1、TN

26、F-α及CGRP作用于Pg-LPS對成骨細胞的活性影響：實驗分別用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨細胞后檢測成骨細胞的活性。結(jié)果顯示：CGRP能夠減弱 Pg-LPS作用下對成骨細胞的活性抑制，但在有 TNF-?存在的情況下，卻無法產(chǎn)生抑制作用。可見，TNF-?在Pg-LPS抑制的成骨細胞活性起著一定的作用。
　　2、TNF-α及CGRP作用于Pg-LPS對成骨細胞的凋亡影響：實驗分

27、別用Pg-LPS、Pg-LPS+CGRP、Pg-LPS+CGRP+TNF-α作用于成骨細胞后檢測成骨細胞的凋亡。結(jié)果顯示：CGRP能夠緩解 Pg-LPS作用下細胞的凋亡，但在有 TNF-?存在的情況下，卻無法產(chǎn)生這種誘導作用。這一結(jié)果與之前的實驗結(jié)果是一致的。
　　3、CGRP減弱Pg-LPS對成骨細胞的凋亡的調(diào)控：本實驗檢測細胞活性表達。結(jié)果顯示：CGRP能抑制Pg-LPS導致的Cleaved-Caspase8、Cleaved-

28、Caspase3蛋白水平的上調(diào)，卻無法抑制 TNF-?、CGRP、Pg-LPS共培養(yǎng)所上調(diào)的 Cleaved-Caspase8和Cleaved-Caspase3的表達。表明：CGRP可以抑制Pg-LPS誘發(fā)的凋亡，但這種現(xiàn)象卻被TNF-?反轉(zhuǎn)了；推測TNF-?很可能就在CGRP抑制Pg-LPS誘導的成骨細胞凋亡作用中扮演著起逆轉(zhuǎn)作用。
　　結(jié)論：
　　1.Pg-LPS抑制成骨細胞活性及誘導成骨細胞凋亡。
　　2.CGR