rhIGF-1對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　 在成骨細(xì)胞(ostelblast，OB)及破骨細(xì)胞(Osteoclast，OC)的表面均表達(dá)有胰島素樣生長因子1(insulin like growth factor1，IGF-I)的受體，IGF-I對這兩種細(xì)胞也都具有激活作用。IGF-1在調(diào)節(jié)骨代謝平衡中具有重要作用，被認(rèn)為是存在于RANKL/OPG系統(tǒng)之上，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞相互作用的核心分子。
　　 為此，本文擬探討不同濃度的rhIGF-I對成骨

2、細(xì)胞和破骨細(xì)胞的直接作用，及對成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞相互作用的調(diào)節(jié)。
　　 方法：
　　 1.利用50ng/ml的RANKL誘導(dǎo)小鼠破骨前體細(xì)胞系分化為成熟破骨細(xì)胞。TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶染色)鑒定。
　　 2.以50ng/ml rhIGF-I分別干預(yù)成細(xì)胞以及分化成熟的破骨細(xì)胞，干預(yù)時間分別為：6min、20min、60min；Western-blotting檢測rhIGF-1R活化情況。
　　 3.

3、分別加入0、2、4、6ug/ml的兔抗rhIGF-I IgG中和培養(yǎng)基中的rhIGF-I，利用Western-blotting進(jìn)行抗體中和濃度的篩選。
　　 4.重新接種成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，用0、10、50、100ng/ml的rhIGF-1分別干預(yù)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞，12小時后終止培養(yǎng)并收集培基，之后實(shí)驗分為三組：A組：rhIGF-1直接干預(yù)組。B組：條件培養(yǎng)基交互培養(yǎng)組：破骨細(xì)胞經(jīng)rhIGF-1干預(yù)后的條件培養(yǎng)基(OC con

4、ditioned medium after rhIGF-1 treatment，OCCM)；成骨細(xì)胞經(jīng)rhIGF-1干預(yù)后的條件培養(yǎng)基(OB conditioned medium after rhIGF-1treatment，OBCM)。濾過OCCM、OBCM后兩細(xì)胞培基互換交互培養(yǎng)12h。C組：rhIGF-1中和后交互培養(yǎng)組：OCCM、OBCM中加入4ug/ml的抗rhIGF-I IgG，中和后再用于交互培養(yǎng)12h。
　　 (

5、1)ELISA檢測各組OB上清液中RANKL、OPG及BGP含量。
　　 (2)實(shí)時熒光定量PCR檢測各組OB中Bgp、Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：
　　 1.50ng/ml的RANKL誘導(dǎo)培養(yǎng)8天后，RAW264.7出現(xiàn)TRAP陽性多核細(xì)胞。
　　 2.50ng/ml rhIGF-1分別干預(yù)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞6、20、60min后，Wester

6、n-blotting檢測隨著rhIGF-1干預(yù)時間的延長磷酸化rhIGF-1R的量逐漸增加，而未磷酸化rhIGF-1R逐漸減少。
　　 3.未加rhIGF-1干預(yù)空白對照組無磷酸化rhIGF-1R；rhIGF-1干預(yù)后可以檢測到大量磷酸化rhIGF-1R；rhIGF-1干預(yù)后培基中加入2ug/ml抗體中和后可檢測到少量磷酸化rhIGF-1R，而加入4、6ug/ml的抗體中和后未檢測到磷酸化rhIGF-1R。同時隨著中和抗體濃度的

7、增加，非磷酸化IGF-IR也增加。
　　 4.(1)當(dāng)rhIGF-1單獨(dú)干預(yù)成骨細(xì)胞時，測定上清液中RANKL、OPG及BGP含量，結(jié)果顯示不同濃度的IGF-1對成骨細(xì)胞合成RANKL、OPG及BGP無影響；而當(dāng)用OCCM及抗體中和后的OCCM培養(yǎng)成骨細(xì)胞時，發(fā)現(xiàn)三種細(xì)胞因子在上清液中的含量均在rhIGF-1初始干預(yù)濃度為10、50ng/mL時明顯高于其他組，并以低劑量組--即rhIGF-1初始濃度為10ng/mL時最高。同時，

8、當(dāng)用抗體中和后的OCCM培養(yǎng)成骨細(xì)胞時，三種細(xì)胞因子在上清液中的表達(dá)在低劑量組明顯高于OCCM培養(yǎng)的成骨細(xì)胞組。
　　 (2)實(shí)時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示rhIGF-1直接干預(yù)OB、OC時，OB中Bgp，Opg、Rankl及OC中Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表達(dá)水平在不同劑量組與未加rhIGF-1干預(yù)的空白組之間無明顯差別；而OCCM與抗體中和后OCCM培養(yǎng)的OB組及OBCM與抗體中和后OBCM培養(yǎng)的OC在rhIGF

9、-1干預(yù)濃度為10ng/ml時Bgp、Opg、Rankl及Ck、Mmp-9、Rank mRNA的表達(dá)水平顯著高于空白組與其他劑量組，統(tǒng)計學(xué)分析表明前者與其它各組表達(dá)水平存在顯著差異(p<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 綜合上述各項指標(biāo)的檢測結(jié)果顯示，rhIGF-1直接干預(yù)成、破骨細(xì)胞時作用不明顯；當(dāng)有另一細(xì)胞參與后，各項檢測指標(biāo)的變化均非常顯著，以低劑量組最為明顯，但不是劑量依賴性。鑒于rhIGF-1已經(jīng)被證實(shí)有顯著的