h1-calponin對小鼠成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的初步研究.pdf

1、調(diào)寧蛋白是一個(gè)具有多種功能的蛋白家族，與許多疾病的發(fā)生發(fā)展都有密切聯(lián)系。堿性調(diào)寧蛋白( h1-calponin)屬于調(diào)寧蛋白家族，近年研究發(fā)現(xiàn)h1-calponin與骨骼發(fā)育及疾病有密切關(guān)系。 骨骼形成主要通過軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨兩種方式來完成。其中骨組織形成的基本過程一致，即間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和密集后分化為成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞分泌類骨質(zhì)，并被包埋其中，成為骨細(xì)胞，繼而類骨質(zhì)鈣化成骨基質(zhì)，最后形成骨組織[12]。 h1-c

2、alponin是調(diào)寧蛋白家族成員之一，目前對其在骨發(fā)育領(lǐng)域研究較少。h1-calponin基因敲除小鼠可出現(xiàn)軟骨及骨形成加快，骨量增加，提示h1-calponin對骨形成具有調(diào)節(jié)作用。在骨折愈合中， h1-calponin敲除小鼠依靠活化的骨膜成骨細(xì)胞的大量增生使得新骨形成增加[3]。這些均提示h1-calponin可能是骨形成的負(fù)性調(diào)節(jié)分子，但具體機(jī)制不明。 h1-calponin作為參與骨骼發(fā)育過程的一種因子，目前研究較少

3、。既往利用基因敲除小鼠研究h1-calponin在骨發(fā)育中的作用，極大地增加了我們對其在骨發(fā)育中作用的認(rèn)識，但利用傳統(tǒng)基因敲除小鼠不能明確h1-calponin對成骨細(xì)胞是直接發(fā)揮作用來影響骨形成，還是通過對軟骨細(xì)胞的間接調(diào)控骨形成，且h1-calponin本身的作用機(jī)制亦不明確。 據(jù)此，本研究計(jì)劃構(gòu)建成骨細(xì)胞中特異性過表達(dá)hl-calponin轉(zhuǎn)基因小鼠模型(colI-calponin)，通過對該小鼠的骨骼表型分析，并結(jié)合體外

4、成骨誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，研究h1-calponin對小鼠成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用，明確其對成骨細(xì)胞的直接作用并探討其分子機(jī)制。 主要實(shí)驗(yàn)方法： 第一部分：colI-calponin轉(zhuǎn)基因小鼠的建立及驗(yàn)證 1、從小鼠腎臟中擴(kuò)增出h1-calponin的cDNA，使用collage I啟動(dòng)子，采用SK質(zhì)粒作為骨架，分別將h1-calponin的cDNA和colI promoter，SV40 polyA裝入SK骨架中，并用SalI

5、和SaclI兩種限制性內(nèi)切酶將構(gòu)建好的載體線性化，經(jīng)純化后顯微注射入小鼠受精卵中。 2、出生小鼠的基因型鑒定：小鼠剪尾后提取基因組DNA，然后采用PCR鑒定小鼠基因型。 3、colI-calponin小鼠與FVB小鼠交配，得到既有colI-calponin，又有野生型的同窩小鼠，根據(jù)性別進(jìn)行分組。 4、分離培養(yǎng)原代小鼠成骨細(xì)胞，提取總RNA，RT-PCR檢測coll-calponin及WT小鼠中h1-calpon

6、in的表達(dá)水平差異。 5、提取colI-calponin及WT小鼠各組織總RNA，RT-PCR檢測h1-calponin的表達(dá)情況，制作表達(dá)譜，驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因小鼠成骨細(xì)胞表達(dá)的特異性。 第二部分：h1-calponin對小鼠成骨細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的初步研究 1、對出生后不同時(shí)期(間隔為1周)的colI-calponin轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行大體觀察(身長、體重、外表特征等)，與同窩同性別WT小鼠對比分析。 2、

7、利用X線攝片、雙能骨密度計(jì)和Micro-CT觀察成年小鼠股骨骨密度及骨組織結(jié)構(gòu)的變化。用三點(diǎn)折斷法檢測其生物力學(xué)特性，并對小鼠血清中鈣、磷含量進(jìn)行測定。 3、全骨架染色并結(jié)合組織切片，全骨架染色(阿辛藍(lán)+茜素紅)大體觀察骨骼發(fā)育；并對2月齡、4月齡小鼠(WT/colI-calponin)脛骨進(jìn)行組織學(xué)切片、染色(HE)來對比觀察小鼠脛骨的結(jié)構(gòu)情況。 4、分離培養(yǎng)原代成骨細(xì)胞，并采用細(xì)胞計(jì)數(shù)法繪制生長曲線以及BrdU標(biāo)記檢

8、測小鼠成骨細(xì)胞增殖情況。 5、對分離培養(yǎng)的原代成骨細(xì)胞進(jìn)行成骨誘導(dǎo)，通過堿性磷酸酶測定，結(jié)合成骨相關(guān)基因的表達(dá)檢測，觀察成骨細(xì)胞分化情況。 6、對成骨誘導(dǎo)的原代成骨進(jìn)行茜素紅染色觀察礦化情況。 7、對原代成骨細(xì)胞采用Western Blot檢測其Erk1/2磷酸化水平。 主要實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 一、成功構(gòu)建成骨細(xì)胞特異性過表達(dá)hl-calponin轉(zhuǎn)基因小鼠(colI-calponin) 1、通過

9、提取小鼠基因組DNA，并采用PCR檢測證實(shí)h1-calponin cDNA成功插入于突變小鼠基因組中。 2、通過RT-PCR檢測colI-calponin及WT小鼠成骨細(xì)胞中h1-calponin的表達(dá)水平，證實(shí)colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞中h1-calponin表達(dá)較WT小鼠顯著性增高。且通過觀察colI-calporun及WT小鼠各組織h1-calponin表達(dá)譜，證實(shí)h1-calponin在成骨細(xì)胞中的特異性過表

10、達(dá)。 二、colI-calponin小鼠成年期骨量減少，骨重建異常，Erk活性增強(qiáng)在其中起重要作用 1、colI-calponin小鼠體重明顯減輕，成年期骨量減少，骨皮質(zhì)生物力學(xué)性能改變，血清中鈣磷含量無明顯變化。 2月和4月齡的colI-calponin小鼠股骨骨密度降低，骨小梁數(shù)量減少，分離度降低；骨皮質(zhì)厚度減小，反映其生物力學(xué)特性的最大值彎曲載荷和彈性模量均增加，但其血清中鈣磷含量則無明顯差異。 2

11、、colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞增殖減弱 2月和4月齡的colI-calponin小鼠脛骨骨小梁稀疏。成骨細(xì)胞生長曲線及BrdU標(biāo)記結(jié)果均提示colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞增殖能力減弱。 3、colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞分化與礦化能力減弱 檢測成骨誘導(dǎo)7天、14天、21天的成骨細(xì)胞分化標(biāo)志基因，結(jié)果顯示colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞堿性磷酸酶表達(dá)減弱；OP表達(dá)下調(diào)；OC表達(dá)顯著性

12、下調(diào)。茜素紅染色檢測成骨誘導(dǎo)14天、21天成骨細(xì)胞，結(jié)果顯示colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成明顯減少，礦化降低。 5、colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞Erk1/2磷酸化蛋白水平明顯增加 Western Blot檢測colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞中Erk1/2磷酸化蛋白水平明顯增加，提示colI-calponin小鼠成骨細(xì)胞增殖、分化和礦化能力的改變可能是由Erk1/2信號途徑活化增強(qiáng)引起的