頭孢地嗪對小鼠中性粒細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　觀察頭孢地嗪(Cefodizime,CDZ)對肺炎克雷伯桿菌(Klebsiella pneumoniae,Kle.p)引起的小鼠肺部炎癥反應(yīng)過程中,中性粒細(xì)胞(Polymorphonuclear neutrophil granulocytes,PMN)分泌細(xì)胞因子的變化,并探討其與LPS-TLR-NFκB信號傳導(dǎo)通路的關(guān)系。
　　方法：
　　1.建立肺炎模型:經(jīng)熱滅活后的Kle.p1x107CFU懸浮于50

2、μlPBS中,經(jīng)鼻吸入法感染小鼠肺部。
　　2.給藥方式及劑量:感染前96h開始給藥,至接種細(xì)菌:將CDZ溶于PBS中30mg/kg,次/12h,皮下注射給藥。
　　3.PMN的分離:感染3-24h后,不連續(xù)密度梯度法分離腹腔灌洗液中的PMN。
　　4.PMN表達(dá)的細(xì)胞因子種類及強(qiáng)度分析:以含有96種細(xì)胞因子基因表達(dá)譜的芯片檢測感染前、后小鼠 PMN表達(dá)細(xì)胞因子種類及強(qiáng)弱變化。
　　5.PMN表達(dá)和分泌的TNF-

3、α和IL-1β檢測:在感染的不同時間,以RT-PCR方法檢測PMN中TNF-α和IL-1β的mRNA表達(dá)情況;以ELISA檢測TNF-α、IL-1β分泌量的變化;以Western blot分析PMN內(nèi)TNF-α、IL-1β蛋白的表達(dá)。
　　6.呼吸爆發(fā)測定:以硝基四氮唑藍(lán)還原實(shí)驗(yàn)(NBT test)檢測PMN氧依賴的呼吸爆發(fā)釋放活性氧的情況。
　　7.LPS-TLR-NFκB信號傳導(dǎo)通路研究: RT-PCR方法檢測PMN中T

4、oll樣受體4(TLR4)mRNA表達(dá)情況;Western blot分析PMN內(nèi)I-κB量的變化以反映其活性變化;凝膠電泳遷移率分析實(shí)驗(yàn)(Electrophoretic mobility shift assay,EMSA)檢測PMN內(nèi)核因子κB(Nuclear factor-κB,NF-κB)的轉(zhuǎn)錄活性。
　　結(jié)果：
　　1.基因芯片分析:小鼠PMN能表達(dá)多種細(xì)胞因子,熱滅活Kle.p可誘導(dǎo)TNF-α及IL-1β等基因表達(dá)增

5、加。
　　2.TNF-α和IL-1?mRNA表達(dá)及CDZ對其影響:
　　(1)小鼠感染熱滅活Kle.p后,PMN中TNF-α和IL-1?的mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)。TNF-α表達(dá)在6h最強(qiáng);IL-1?表達(dá)在12h達(dá)到最高;24h后二者表達(dá)均明顯減弱但仍較對照組強(qiáng)。
　　(2)與模型組相比,CDZ促進(jìn)感染3-6h后TNF-α和IL-1β表達(dá),但削弱了感染12-24h的TNF-α和24h后的IL-1βmRNA表達(dá)。
　　

6、(3) CDZ對未感染小鼠PMN的TNF-α和IL-1βmRNA表達(dá)未見明顯影響。
　　3.PMN胞內(nèi)TNF-α和IL-1?蛋白表達(dá)及CDZ對其影響
　　(1)在未感染小鼠PMN胞內(nèi)TNF-α和IL-1β蛋白量較少,以Western blot手段較難檢出。Kle.p感染3h后,可見PMN胞內(nèi)細(xì)胞因子的蛋白表達(dá)增加,6h后最高,12h后降低。
　　(2)與模型組相比,CDZ增強(qiáng)了感染小鼠感染3h后的TNF-α和3-12h

7、的IL-1βPMN胞內(nèi)蛋白表達(dá),而降低感染12h后的TNF-α和24h后的IL-1β表達(dá)。
　　(3)CDZ對未感染小鼠PMN胞內(nèi)TNF-α和IL-1β的蛋白表達(dá)未見明顯影響。
　　4. PMN分泌的TNF-α、IL-1β水平及CDZ對其影響:
　　(1)小鼠感染熱滅活Kle.p后,PMN分泌的TNF-α及IL-1β水平升高;TNF-α在感染后6h最高,24h后明顯降低,但仍較對照組高;而IL-1β在12h最高,24h

8、后仍有較高分泌量。
　　(2)與模型組相比,CDZ增加了感染Kle.p小鼠3-6h后PMN的TNF-α和IL-1β分泌量、而降低感染12h后二者的分泌量。
　　(3)CDZ對未感染小鼠PMN的TNF-α和IL-1β分泌未見明顯影響。
　　5.PMN的呼吸爆發(fā):
　　(1)熱滅活Kle.p感染促進(jìn)小鼠PMN的呼吸爆發(fā),以感染3h后最強(qiáng),此后漸低,但24h后仍較未感染組強(qiáng)。
　　(2)與模型組相比,CDZ加強(qiáng)了

9、小鼠感染3h后的呼吸爆發(fā),12h后降低其呼吸爆發(fā)強(qiáng)度,24h后幾乎回落至感染前水平。
　　(3)CDZ對未感染小鼠的呼吸爆發(fā)無明顯影響。
　　6.LPS-TLR-NFκB信號傳導(dǎo)通路:
　　(1)感染Kle.p后PMN中I-κB水平明顯降低,感染3h最低,6h后回升,但在相同時間點(diǎn)上仍較未感染組低。與感染組相比,CDZ處理可進(jìn)一步降低感染6h內(nèi)小鼠PMN中I-κB水平,而升高12-24h后其水平;對未感染小鼠I-κB水

10、平未見明顯影響。
　　(2)感染Kle.p刺激3h后TLR4的mRNA表達(dá)明顯增加;6-24h后的增加不明顯。CDZ促進(jìn)感染3-24h后的表達(dá),3h后最明顯。對未感染小鼠也有促進(jìn)TLR4mRNA表達(dá)的作用。
　　(3)在對照組小鼠PMN中,未見NF-κB的激活,Kle.p感染后NF-κB的DNA結(jié)合活性明顯加強(qiáng),3h后最強(qiáng),隨后逐漸減弱。CDZ明顯加強(qiáng)感染6h內(nèi)PMN的NF-κB活性,而在12h后則減弱其活性。CDZ對未感染