法氏囊活性肽的分離鑒定及其免疫調(diào)節(jié)作用機制研究.pdf

1、法氏囊(Bursa of Fabricius)是目前世界上唯一公認的體液中樞免疫器官。B-淋巴細胞這一術語來源于“bursa-derived lymphocyte”。Science文章證實囊素三肽(Lys-His-Gly)是第一個法氏囊來源的促進體液免疫反應的活性分子。臨床應用研究發(fā)現(xiàn)，法氏囊組織滅活疫苗無論對法氏囊病毒超強毒還是變異株的免疫保護效果都是最好的，遠超過其它法氏囊細胞苗、雞胚苗。豬瘟脾淋苗的保護效果遠遠高于豬瘟細胞苗，脾臟

2、轉移因子有明顯的免疫增強效果，市場很火，這些說明禽類和哺乳動物的免疫器官中存在共同的促進免疫反應的活性分子。目前，臨床上主要依靠疫苗進行疫病預防。研究體液免疫系統(tǒng)中、促進疫苗整體免疫效果的活性分子對當前臨床疫病防治具有重要意義。
　　 在哺乳動物中，B細胞分化器官一直懸而未決，骨髓僅被認為是類囊器官。目前對哺乳動物、人類和鳥類共有的T細胞分化發(fā)育器官胸腺及其活性成分的研究非常深入;而與胸腺相對應的、B細胞發(fā)育器官法氏囊的研究報道

3、則比較少。法氏囊是體液中樞免疫器官發(fā)現(xiàn)于1956年，但至今，除了囊素，其他法氏囊活性分子及其作用機制鮮有報道。新型法氏囊活性肽的研究是體液中樞免疫系統(tǒng)研究的重要環(huán)節(jié)，對研究人類和哺乳動物的中樞體液免疫器官具有重要的指導意義。
　　 本研究攻克了法氏囊組分復雜、難以純化的技術難題，新分離到9種多肽分子，并對這些分子進行了系統(tǒng)的研究，包括體液免疫、細胞免疫、作用受體、免疫調(diào)節(jié)作用機制、B細胞分化調(diào)控機制、物質(zhì)代謝、信號轉導及抗腫瘤等

4、多方面的研究，取得了突破性進展。本研究主要內(nèi)容包括:
　　 1新的法式囊多肽分離及免疫調(diào)節(jié)活性初步鑒定
　　 本研究采用超濾濃縮、反向高效液相和質(zhì)譜相結合的方法，從500g法氏囊組織中成功分離到9種新的法氏囊多肽（表1）。法氏囊多肽分別以50μg/mL劑量與禽流感病毒(AIV， H9N2)滅活疫苗混勻，腹腔注射免疫小鼠兩次，初步驗證了新分離法氏囊多肽具有免疫調(diào)節(jié)和促生長作用（表1）。據(jù)此，本研究篩選了BSP-Ⅰ、BSP-

5、Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ，對其在雞體內(nèi)和哺乳動物體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)功能進行詳細研究。
　　 2法氏囊活性肽在雞體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)作用研究
　　 為了探討法氏囊新活性肽的免疫調(diào)節(jié)作用，在雞模型中分別評價BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ對AIV疫苗或AIV抗原的免疫效果影響。通過檢測HI抗體、細胞因子IL-4和IFN-γ水平發(fā)現(xiàn)，BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ均明顯促進抗體水平升高，但是其對細胞因子反

6、應的調(diào)節(jié)略有差異。BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅰ同時促進Th1型（干擾素-γ）和Th2型(IL-4)細胞因子產(chǎn)生，說明這三種法氏囊活性肽能夠誘導Th1和Th2型免疫反應。而BPP-Ⅱ主要促進雞Th2型(IL-4)細胞因子產(chǎn)生，暗示在雞免疫模型中，BPP-Ⅱ主要誘導Th2型反應。不過，其活性與劑量之間的關系還有待于進一步研究。
　　 3法氏囊活性肽在小鼠體內(nèi)中的免疫調(diào)節(jié)作用研究
　　 為了探討法氏囊活性肽在哺乳動物體內(nèi)

7、的免疫調(diào)節(jié)活性，本研究以小鼠為試驗動物，用不同劑量的合成的法氏囊多肽BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ分別與AIV滅活疫苗或抗原充分混勻后，以腹腔注射的接種方式免疫BALB/c小鼠2次。結果發(fā)現(xiàn)，這四種法氏囊活性肽均具有免疫調(diào)節(jié)活性，包括促進抗體產(chǎn)生、提高細胞因子水平、促進T細胞亞型表達及脾臟淋巴細胞活力增加等方面，其不同之處表現(xiàn)在:
　　 (1)第一次免疫時，BSP-Ⅰ聯(lián)合免疫組IgG抗體水平明顯升高，不過重復免疫

8、時抗體水平反而下降;
　　 (2) BSP-Ⅱ聯(lián)合免疫組IgG抗體升高，且第二次免疫時抗體水平高于第一次免疫。不過，隨著BSP-Ⅱ劑量增加，細胞因子（IL-4和IFN-γ）水平反而下降;
　　 (3)在AIV疫苗和AIV抗原兩種免疫模型中，BPP-Ⅰ對IgG抗體和細胞因子(IL-4和IFN-γ)產(chǎn)生、T細胞亞型表達及淋巴細胞活力的調(diào)節(jié)活性相同;
　　 (4)在AIV疫苗和AIV抗原兩種免疫模型中，BPP-Ⅱ對Ig

9、G抗體和細胞因子(IL-4和IFN-γ)產(chǎn)生、T細胞亞型表達及淋巴細胞活力的調(diào)節(jié)活性不同。
　　 這些數(shù)據(jù)表明法氏囊活性肽的免疫調(diào)節(jié)活性沒有種屬特異性，可以作為新的強效免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強劑應用于哺乳動物的疾病防控，不過，其免疫調(diào)節(jié)活性與其劑量、免疫類型等有關。
　　 4采用噬菌體文庫篩選法氏囊活性肽在B淋巴細胞中的作用受體
　　 法氏囊是B細胞分化、成熟的關鍵器官。為了研究法氏囊新活性肽在B細胞中作用蛋白，分別

10、以活性肽BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ為靶蛋白，采用雞B淋巴細胞cDNA T7噬菌體展示文庫進行篩選。三輪篩選后，PCR擴增富集噬菌體克隆的插入片段。BP5是本實驗室近期報道的一種法氏囊活性分子。鑒于其抗氧化和免疫調(diào)節(jié)功能，我們也對其作用受體進行了研究。PCR產(chǎn)物序列同源分析，初步確定了分別與BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ和BP5作用的受體蛋白（表2），為深入研究法氏囊活性肽的生物學功能提供了新的方向。<

11、br>　　 5采用鼠源基因芯片技術研究法氏囊活性肽對雜交瘤細胞的免疫調(diào)節(jié)作用機制
　　 為了研究法氏囊活性肽在體外對抗體產(chǎn)生的影響，采用BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ、BPP-Ⅱ和BP5分別刺激雜交瘤細胞。結果顯示，這些法氏囊活性肽以不同的劑量依賴性方式調(diào)節(jié)雜交瘤細胞分泌抗體。
　　 為了進一步研究法氏囊活性肽調(diào)節(jié)免疫的作用機制，本研究以雜交瘤細胞為免疫細胞模型，采用基因芯片技術分別檢測5μg/mL BSP-Ⅱ、0

12、.2μg/mL BPP-Ⅱ和2μg/mL BP5刺激雜交瘤細胞的基因表達情況，并進行了通路分析，如表3所示。GO分類分析發(fā)現(xiàn)，法氏囊活性肽BSP-Ⅱ、BPP-Ⅱ和BP5調(diào)控的基因分別參與多種免疫反應相關的生物學過程，如T細胞活化和增殖、B細胞活化及其介導的免疫、細胞因子產(chǎn)生等。
　　 這些結果提供了法氏囊活性肽調(diào)控免疫反應的分子基礎，為研究中樞體液免疫器官調(diào)控機體免疫反應的作用機制和臨床實踐應用提供了重要的理論依據(jù)。
　　

13、 6采用禽源基因芯片技術研究法氏囊活性肽對未熟成B細胞的作用機制
　　 法氏囊在B細胞的發(fā)展分化過程中發(fā)揮極其重要的作用。但法氏囊活性肽調(diào)節(jié)B4細胞發(fā)育的作用機制尚不清楚。為了研究法氏囊活性肽對未成熟B細胞活性的作用，本研究以禽pre-B細胞系DT40細胞為模型，首先檢測了各種法氏囊活性肽對禽DT40細胞活力的影響。結果顯示，BP5和BSP-Ⅰ以劑量依賴性方式抑制DT40細胞增殖，BSP-Ⅱ則明顯促進DT40細胞增殖，低劑量的

14、BPP-Ⅱ促進DT40細胞活性增加，而BPP-Ⅰ對DT40細胞活性影響不大。
　　 為了深入了解法氏囊活性肽對未成熟B細胞分化調(diào)節(jié)的作用機制，本研究采用基因芯片技術，檢測了BP5、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅱ刺激后DT40細胞中分子水平變化情況。通路分析發(fā)現(xiàn)，BP5、BSP-Ⅱ和BPP-Ⅱ分別調(diào)控多種細胞內(nèi)通路過程（表4）。
　　 這些結果揭示了法氏囊活性肽調(diào)控未成熟B細胞的作用機制。這些數(shù)據(jù)為深入研究中樞免疫器官調(diào)控機體B細

15、胞分化和體液免疫反應提供了重要的實驗依據(jù)。
　　 7法氏囊活性肽抗腫瘤作用機制研究
　　 為了探索法氏囊活性肽是否具有抗腫瘤功能，本研究以腫瘤細胞系Hela和MCF-7為腫瘤細胞模型，采用MTT方法檢測細胞活力。結果顯示，法氏囊活性肽以不同程度調(diào)控腫瘤細胞的增殖活力。BP5和BSP-Ⅰ明顯抑制腫瘤細胞生長，而BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ對腫瘤細胞增殖的有正負雙重作用，即低濃度時，促進腫瘤細胞增殖，而高濃度時，則抑制

16、腫瘤細胞增殖。本研究中沒有發(fā)現(xiàn)五種法氏囊活性肽對普通細胞增殖具有抑制作用。
　　 為了進一步研究法氏囊活性肽抗腫瘤的作用機制，本研究以抑癌分子p53為模型展開試驗。Luciferase活性和West-blotting結果顯示，BP5、BSP-Ⅰ、BSP-Ⅱ、BPP-Ⅰ和BPP-Ⅱ分別以不同的劑量方式增強p53活性，促進p53蛋白表達和p53蛋白穩(wěn)定。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，各種法氏囊活性肽能促進促細胞凋亡分子Bax蛋白的表達。結果表