翡翠貽貝糖胺聚糖抗腫瘤活性及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:以翡翠貽貝全臟器為原料,優(yōu)化翡翠貽貝糖胺聚糖粗品(PVG)的提取工藝條件,經(jīng)初步純化后對其抗腫瘤活性進行研究,并探討其在免疫調(diào)節(jié)作用方面的抗腫瘤機理。
　　 方法:1.采用二次回歸正交旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計研究料液比、加酶量、酶解時間3個因素對糖胺聚糖粗品得率與糖胺聚糖含量乘積的影響,從而確定翡翠貽貝糖胺聚糖粗品(PVG)提取的最佳工藝條件。2.將粗品溶解后,調(diào)整溶液pH值,使大部分蛋白沉淀后,冷凍干燥得精制品(PVG－1),DEA

2、E－52－纖維素純化PVG－1得到翡翠貽貝糖胺聚糖純化品(PVG-1a)3.采用最大耐受劑量實驗對PVG－1的急性毒性進行檢驗。4.MTT法檢測PVG－1和PVG－1a對體外培養(yǎng)的K562慢性髓性白血病細胞、CNE－2Z人鼻咽癌細胞和S180骨肉瘤細胞的抑制作用,并探討PVG－1和PVG－1a對5－Fu的增敏作用；在體外實驗基礎(chǔ)上,體內(nèi)實驗驗證PVG－1對S180移植瘤的抑制作用。5.采用計算免疫器官指數(shù)法檢測PVG－1對正常小鼠、免疫

3、抑制小鼠及荷瘤小鼠的脾指數(shù)、胸腺指數(shù)的影響；檢測PVG、PVG－1、PVG－1a體外對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅及產(chǎn)生一氧化氮(NO)能力的影響；通過脾細胞增殖實驗檢測PVG、PVG－1、PVG－1a體外對小鼠脾淋巴細胞增殖的影響；通過脾淋巴細胞與K562腫瘤細胞的共培養(yǎng),體外檢測PVG、PVG－1、PVG－1a對自然殺傷細胞(NK細胞)活性的影響。
　　 結(jié)果:1.獲得了翡翠貽貝糖胺聚糖提取的最佳工藝組合:液料比2.30:1、

4、加酶量0.94％、酶解時間3.46h,模型預(yù)測值為25.50(×104),重復(fù)驗證實驗結(jié)果與預(yù)測值的標準誤差為1.10％,低于5％。重復(fù)驗證實驗糖胺聚糖粗品平均得率為0.99％,糖胺聚糖平均含量為26.04％。2.經(jīng)過初步精制和離子交換柱層析純化,翡翠貽貝糖胺聚糖的含量逐步提高,精制品PVG－1中糖胺聚糖含量為45.6％；經(jīng)柱層析后的純化品中糖胺聚糖含量為59.4％。3.最大耐受量實驗結(jié)果顯示,翡翠貽貝糖胺聚糖精制品PVG－1對小鼠的經(jīng)

5、口急性毒性劑量大于15.0 g·kg-1。4.(1)PVG－1對K562慢性髓性白血病細胞、CNE-2Z人鼻咽癌細胞的生長有抑制作用；PVG－1和PVG-1a對體外培養(yǎng)的S180骨肉瘤細胞的生長有顯著抑制作用；PVG－1、PVG－1a與5－Fu合用可以增敏5－Fu的抗腫瘤藥效。(2)PVG－1對小鼠體內(nèi)S180移植瘤的生長具有顯著抑制作用,200 mg·kg-1的PVG－1的抑制率達到60.6％;CTX與PVG-1合用組的抑制率達到78

6、.8％,顯著提高了CTX的抑瘤效果。5.(1)PVG-1能夠提高正常小鼠脾指數(shù)和胸腺指數(shù),200mg/kg劑量PVG－1對正常小鼠脾指數(shù)的提高最明顯,100mg/kg劑量PVG-1對對正常小鼠胸腺指數(shù)的提高最明顯:PVG－1能夠修復(fù)由CTX引起的小鼠免疫低下狀況。(2)PVG－1各劑量組都能夠提高荷瘤小鼠的脾指數(shù)和胸腺指數(shù),在所選實驗劑量范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的劑量效應(yīng)關(guān)系；PVG－1中劑量(100 mg/kg)能修復(fù)由于CTX治療腫瘤的同時

7、導(dǎo)致的荷瘤小鼠免疫低下。(3)PVG、PVG－1和PVG－1a能顯著增強小鼠腹腔巨噬細胞吞噬中性紅和產(chǎn)生NO的能力；PVG、PVG－1和PVG－1a各劑量組均能顯著促進小鼠脾淋巴細胞增殖,樣品相同劑量條件下,PVG－1a的刺激指數(shù)高于PVG－1,PVG－1高于PVG；200μg/ml的PVG－1a與ConA協(xié)同刺激脾淋巴細胞增殖的效果最好,刺激指數(shù)達到1.63。(4)PVG、PVG－1和PVG－1a的四個劑量作用的NK細胞能夠增強NK細