厚殼貽貝糖胺聚糖結(jié)構(gòu)及抗腫瘤活性測定.pdf

1、本文的研究對(duì)象是厚殼貽貝中提取得到的水溶性多糖，以酶提取法取代傳統(tǒng)的熱水提取法，進(jìn)行多糖提取，并對(duì)提取條件進(jìn)行了優(yōu)化。此外，對(duì)粗多糖進(jìn)行了分離純化、基本理化性質(zhì)、體外抗氧化活性、細(xì)胞水平的抗腫瘤能力等方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。主要研究成果如下：
　　1.多糖提取工藝的優(yōu)化
　　本文分別進(jìn)行了木瓜蛋白酶和胰蛋白酶的單因素試驗(yàn)，并采用正交試驗(yàn)進(jìn)行優(yōu)化，主要考察了加酶量、提取的時(shí)間和溫度以及pH等因素對(duì)多糖提取率的影響，然后通過正交優(yōu)化得到最

2、佳提取條件，最后進(jìn)行兩步聯(lián)合酶提法。比較三種酶提法的提取率后確定最優(yōu)提取方案，單一酶提取的最佳提取條件分別為：木瓜蛋白酶為加酶量：0.5％，提取時(shí)間：4h，提取溫度：40℃，pH：7；胰蛋白酶加酶量：0.7%，提取時(shí)間：4h，提取溫度：40℃，pH:9。提取率分別為：木瓜蛋白酶提法最佳提取率為5.02%；胰蛋白酶法最佳提取率為5.38%；而兩步聯(lián)合酶解法提取率為6.02%。結(jié)果表明：聯(lián)合酶提法的提取率略高于單一酶提法。
　　2.粗

3、多糖的分離純化及理化性質(zhì)測定
　　粗多糖依次通過 Q-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱和 Sephacryl S-300 High Resolution凝膠柱進(jìn)行分離純化，得到4個(gè)組分MT0、MT0.1-1、MT0.1-2、MT1.2。對(duì)4個(gè)組分進(jìn)行了多種理化性質(zhì)的測定：包括總糖含量、蛋白質(zhì)含量、氨基糖含量、糖醛酸含量等，總糖含量結(jié)果依次為：61.00%、62.47%、62.25、39.23%；蛋白含量依次為：0

4、、0、0、1.15%；氨基糖含量分別為0.24%、0.42%、0.24%以及1.64%；而糖醛酸含量分別為16.15%、20%、11.83%和8.8%。此外，還對(duì)4種多糖結(jié)構(gòu)進(jìn)行了紅外分析，紅外結(jié)果顯示：MT1.2與其它三種多糖在結(jié)構(gòu)上存在較大差異，MT0、MT0.1-1、MT0.1-2初步斷定為α-D-葡萄吡喃糖，而MT1.2初步分析為B-呋喃糖。3.抗氧化和抗腫瘤的體外活性評(píng)價(jià)
　　主要進(jìn)行了酶提粗多糖體外抗氧化活性以及MT0

5、、MT0.1-1、MT0.1-2和MT1.2體外抗腫瘤活性的測定。粗多糖體外抗氧化包括DPPH的清除、羥基自由基的清除、超氧陰離子的清除以及還原力的測定。體外抗氧化的數(shù)據(jù)顯示，隨著樣品濃度增加，抗氧化活性依次遞增，但與陽性對(duì)照Vc存在較大差距。當(dāng)樣品濃度為3mg/mL時(shí)，樣品清除率依次為63.20%、19.60%、27.00%，還原力為0.231。體外抗腫瘤主要采用MTT法來檢測多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞 SPC-A-1和 DU-145的抑制率，并

6、采用 HE染色和ELISA實(shí)驗(yàn)從形態(tài)上以及細(xì)胞因子兩方面闡述了厚殼貽貝多糖的抗腫瘤活性。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：多糖的體外抗腫瘤活性與作用濃度和作用時(shí)間呈正相關(guān)性，當(dāng)多糖濃度為2mg/mL，作用時(shí)間為60h時(shí)，MT0對(duì)SPC-A-1和DU-145細(xì)胞的抑制率分別為20.15%和26.53%；MT0.1-1的抑制率分別為28.95%和24.92%；MT0.1-2的抑制率則為25%和30.14%；MT1.2的抑制率分別為30.87%和34.80