仿刺參糖胺聚糖溶劑殘留檢測方法建立及免疫活性研究.pdf

1、仿刺參(Apostichopus japonicus Selenka)廣泛分布于我國北方海域,具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值。海參多糖是海參中重要的活性組分,具有多種生物學功能和藥理活性,在細胞的生命活動中發(fā)揮重要作用。仿刺參糖胺聚糖(HGAG)作為海參多糖中的酸性多糖,其獨特的分子結構和突出的免疫調節(jié)活性,表現(xiàn)出廣闊的藥物開發(fā)前景。國內(nèi)外有關海參及海參多糖的研究取得了一定的進展,但僅局限于海參粗提物或粗多糖的初步活性篩選,尚未見有關HG

2、AG的純化分析及其免疫調節(jié)活性的系統(tǒng)報道。本文的主要目的是分離得到純化的HGAG,分析醋酸根和乙醇溶劑殘留,研究其在非特異性免疫和特異性免疫等方面的免疫調節(jié)活性,為HGAG的開發(fā)應用奠定基礎。
　　實驗采用堿提取、酶解和乙醇沉淀得到仿刺參粗多糖;雙氧水脫色、三氯乙酸除蛋白得到仿刺參精制多糖;最后通過Q-FF陰離子交換柱層析和透析得到純化HGAG。利用凝膠滲透色譜(GPC)進行分析鑒定,結果表明純化得到的HGAG純度較高、分子量均一

3、,重均分子量(Mw)為94091。多糖提取分離中有機溶劑的使用會造成醋酸根和乙醇的殘留,因此分別建立了醋酸根和乙醇的氣相色譜測定方法,并進行了方法學驗證,結果表明所建立的檢測方法快速、準確、可靠性高。利用建立的方法測得HGAG中醋酸根和乙醇的殘留量分別為0.18％和0.013%,符合《中國藥典》中第三類有機溶劑殘留限量0.5%的要求。
　　為研究HGAG對非特異性免疫的調節(jié)作用,觀察HGAG對小鼠腹腔巨噬細胞(Mφ)功能的影響。不

4、同濃度HGAG作用于體外分離培養(yǎng)的腹腔巨噬細胞,倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化,MTT法測定細胞代謝活力,中性紅測定吞噬能力,試劑盒測定巨噬細胞中的乳酸脫氫酶(LDH)和酸性磷酸酶(ACP)活性,Griess法測定一氧化氮(NO)產(chǎn)生,雙抗夾心ELISA法測定培養(yǎng)上清中TNF-α、IL-1β等細胞因子的分泌。結果表明,HGAG在0.1~25μg·mL-1范圍內(nèi)對巨噬細胞有一定的促進作用;在1~10μg·mL-1范圍內(nèi)與空白對照組相比可顯著增

5、強巨噬細胞的代謝活力和吞噬能力(P<0.01),提高LDH、ACP酶活力和NO生成量(P<0.05),顯著增加培養(yǎng)上清中TNF-α和IL-1β的濃度(P<0.01);與陽性對照組相比,在1~10μg·mL-1范圍內(nèi)對Mφ吞噬功能以及TNF-α、IL-1β的生成有更好的促進作用(P<0.05);在高濃度(100μg·mL-1)Mφ各項功能指標均低于空白對照組。說明HGAG在1~10μg·mL-1濃度范圍內(nèi)可顯著促進Mφ活性,并在一定程度上

6、優(yōu)于陽性對照組。表明HGAG能夠激活Mφ,促進機體的非特異性免疫功能。
　　為研究HGAG對特異性免疫的調節(jié)作用, MTT法測定脾淋巴細胞的增殖,利用攻擊前后足距腫脹度反應遲發(fā)型變態(tài)反應,利用血清溶血素和抗體生成細胞數(shù)反應抗體產(chǎn)生量和 B淋巴細胞的激活。結果表明, HGAG在0.05~25μg·mL-1范圍內(nèi)與空白對照組相比可以顯著促進脾淋巴細胞的轉化( P<0.05),在0.5~10μg·mL-1范圍內(nèi)促進作用高于陽性對照組(

7、P<0.05)。低、中、高劑量的HGAG均能促進遲發(fā)型變態(tài)反應,增加血清溶血素生成和抗體生成細胞數(shù)(P<0.05),且高劑量組的作用效果優(yōu)于中、低劑量組,具有一定的濃度依賴性。表明HGAG對T、B淋巴細胞均有激活作用,并能增加抗體的產(chǎn)生,促進機體的特異性免疫功能。
　　本論文分離純化得到的HGAG分子量均一,有機溶劑殘留符合要求,并且具有良好的免疫調節(jié)活性。在非特異性免疫方面,可以從多個途徑激活巨噬細胞,促進巨噬細胞功能;在特異性