仿刺參卵多肽、多糖的制備及多肽活性研究.pdf

1、本課題以仿刺參加工的副產(chǎn)物-仿刺參生殖腺為原料,經(jīng)顯微鑒定后分出仿刺參卵和仿刺參精,對(duì)精和卵的營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定。然后以仿刺參卵為研究對(duì)象,優(yōu)化了其酶解工藝條件,結(jié)合超濾法制備出仿刺參卵多糖和梯級(jí)肽,對(duì)梯級(jí)肽的化學(xué)抗氧化活性及細(xì)胞活性進(jìn)行了研究,最后以得率和活性為導(dǎo)向分離出純化多肽。
　　主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.仿刺參生殖腺營(yíng)養(yǎng)成分測(cè)定
　　仿刺參卵營(yíng)養(yǎng)較均衡,其中粗蛋白含量達(dá)到50.72g/100g,粗多糖含量高

2、達(dá)27.25g/100g,粗脂肪中多以磷脂形式存在。使用高效液相色譜分析仿刺參卵氨基酸組成,得出仿刺參卵氨基酸總量及必需氨基酸的總量分別為347.19mg/g和176.27mg/g。含量較高的氨基酸有Glu、Asp、Leu和Lys。
　　仿刺參精的粗蛋白含量高達(dá)72.76g/100g,其中氨基酸總量與必需氨基酸總量分別為536.95mg/g和250.74 mg/g,含量較高的氨基酸有Glu、Lys、Ala、Asp和Arg。

3、　　2.仿刺參卵酶解工藝條件優(yōu)化
　　通過(guò)酶種類(lèi)的篩選,水解方式的選擇,確定了最佳酶解工藝條件,即先以混合酶(木瓜蛋白酶:復(fù)合蛋白酶=1:1,酶質(zhì)量比)在加酶量2％、酶解溫度75℃條件下酶解4h,煮沸滅酶活后添加風(fēng)味蛋白酶在加酶量1.5%、酶解溫度45℃條件下繼續(xù)酶解1h,在此工藝條件下仿刺參卵的水解度達(dá)到了77.11%。
　　本實(shí)驗(yàn)采用了三種外源酶,并結(jié)合海參卵中的自溶酶,從而形成了多酶體系,結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)對(duì)仿刺參卵的酶解

4、工藝優(yōu)化成功,不僅節(jié)約了成本,提高了經(jīng)濟(jì)效益,并且水解過(guò)程產(chǎn)生了豐富的多肽與氨基酸,得到的水解液鮮香濃郁,顏色鮮亮,狀態(tài)均勻澄清,可用于開(kāi)發(fā)風(fēng)味獨(dú)特的功能食品。
　　3.仿刺參卵多糖的制備
　　本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用梯度稀釋法,優(yōu)化了超濾法分離仿刺參卵多糖、多肽及制備仿刺參卵梯級(jí)肽的工藝方法。試驗(yàn)中使用三氯醋酸法沉淀可得到除去蛋白的多糖,通過(guò)紫外光譜掃描沉淀的多糖,發(fā)現(xiàn)在190nm到200nm處有強(qiáng)烈單一吸收峰,在其它波長(zhǎng)處基本無(wú)吸

5、收。然后采用葡聚糖凝膠G-100對(duì)精制后的多糖進(jìn)行純化,分離得到一個(gè)無(wú)拖尾的多糖峰,采用葡聚糖凝膠G-200在線檢測(cè),結(jié)果顯示只有一個(gè)譜峰。使用標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖進(jìn)行洗脫對(duì)比,得出仿刺參卵純化后的多糖分子質(zhì)量大于200KDa。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)獲得了分子質(zhì)量相對(duì)集中的仿刺參卵純化多糖。
　　4.梯級(jí)肽制備及其活性研究
　　通過(guò)超濾法分離制備得到三種截留分子質(zhì)量范圍的梯級(jí)肽,即 F1:分子質(zhì)量1～10KDa的多肽、F2:分子質(zhì)量650Da~1

6、KDa的多肽和F3:分子質(zhì)量﹤650Da的多肽,三種梯級(jí)肽的得率分別為 F1:0.737%、F2:0.295%及 F3:0.515%(鮮重)。
　　對(duì)分離得到的仿刺參卵梯級(jí)肽進(jìn)行了化學(xué)抗氧化研究和細(xì)胞活性研究,化學(xué)抗氧化結(jié)果顯示,F1、F2及F3均體現(xiàn)出較強(qiáng)的清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基能力,并且在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)量效關(guān)系。其中F1與F2和F3相比表現(xiàn)出明顯較高的DPPH?和O2-?的清除能力,而在清除?OH

7、的能力方面3個(gè)組分基本相似。細(xì)胞活性結(jié)果顯示,仿刺參卵多肽三個(gè)組分對(duì)巨噬細(xì)胞都起到一定的增殖作用,且終濃度為100、200、400μg/mL的樣品對(duì)過(guò)氧化氫損傷的巨噬細(xì)胞保護(hù)作用非常明顯,三個(gè)樣品的吸光度值與模型組相比為極顯著差異(P<0.01),仿刺參卵梯級(jí)肽在細(xì)胞活性上F1組分略好于另外兩個(gè)組分。
　　5.多肽純化及理化分析
　　F1組分經(jīng)過(guò)Tricine-SDS-PAGE電泳分離,結(jié)果顯示F1有多條條帶,分子質(zhì)量集中分

8、布在6.5~35KDa之間。然后使用高速逆流色譜法分離F1得到4個(gè)獨(dú)立的譜峰,通過(guò)測(cè)定其四個(gè)組分清除自由基能力,得出F1四個(gè)組分的自由基清除能力均高于三種梯級(jí)肽,其中 F1-1組分清除?OH的能力最強(qiáng),當(dāng)濃度為5mg/mL時(shí),清除?OH的能力達(dá)到了82.95U/mL。
　　將F1-1先后經(jīng)過(guò)Sephadex G-100和Sephadex G-50進(jìn)行分離純化后,得到三個(gè)組分,其中F1-1-3是一個(gè)窄高峰,含量是三個(gè)組分中最高的。實(shí)

9、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)F1-1-1和F1-1-3表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除?OH的能力,且都高于F1-1。當(dāng)F1-1-3濃度為5mg/mL時(shí),清除?OH的能力達(dá)到了89.82 U/mL。
　　F1-1-3經(jīng)過(guò)Tricine-SDS-PAGE電泳分離檢測(cè),顯示出一條清晰無(wú)拖尾條帶,說(shuō)明 F1-1-3已經(jīng)達(dá)到電荷均一。與標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白對(duì)比得出,其分子質(zhì)量在30KDa左右。紫外全波長(zhǎng)掃描顯示F1-1-3在紫外有兩處吸收峰,分別是肽鍵和苯丙氨酸的特征吸收位置,使