農(nóng)獸藥多殘留免疫分析檢測(cè)方法研究進(jìn)展

1、<p>　　農(nóng)獸藥多殘留免疫分析檢測(cè)方法研究進(jìn)展</p><p>　　作者：謝桂勉 沈玉棟 孫遠(yuǎn)明</p><p>　　摘要:綜述了免疫分析法在擬除蟲菊酯、氨基甲酸酯、有機(jī)磷、氟喹諾酮、磺胺5種農(nóng)獸藥多殘留檢測(cè)上的應(yīng)用情況,著重討論了抗原設(shè)計(jì)、抗體制備和方法建立等核心技術(shù)的研究進(jìn)展,并對(duì)檢測(cè)方法的發(fā)展進(jìn)行了展望。 </p><p>　　關(guān)鍵詞:農(nóng)獸藥;多殘

2、留;免疫分析法 </p><p>　　AbstractThe applications of immunoassay methods in the multi-residue determination of pyrethroids,carbamate,organophosphorus,fluoroquinolones and sulfonamides were summarized in this paper.

3、 The study advancers on core techniques,such as antigen design,antibody production and method development,were discussed emphatically,and the further trend of immunoassay methods was proposed. </p><p>　　Key

4、wordspesticides and veterinary drugs;multi-residue;immunoassay </p><p>　　農(nóng)獸藥殘留危害人們的生活健康,是食品安全檢測(cè)的關(guān)注焦點(diǎn)?；谔禺愋钥贵w的酶免疫分析方法作為一種簡(jiǎn)便、快速和靈敏的檢測(cè)方法,在近年來的食品安全檢測(cè)中起到越來越重要的作用。采用酶免疫試劑盒、膠體金試紙條高通量、快速篩選陽性樣品后,再用儀器確證的方法得到檢驗(yàn)監(jiān)測(cè)單位的普遍認(rèn)

5、可。已成功應(yīng)用的檢測(cè)產(chǎn)品有克倫特羅、萊克多巴胺試劑盒和試紙條等。其他如孔雀石綠、蘇丹紅、呋喃西林、恩諾沙星等快速檢測(cè)產(chǎn)品也已投放市場(chǎng),推廣使用還需要一定時(shí)間的驗(yàn)證。然而一個(gè)不爭(zhēng)的事實(shí)就是,對(duì)于檢測(cè)如磺胺類、氟喹諾酮類、有機(jī)磷類、擬除蟲菊酯類等有害物質(zhì)時(shí),使用單殘留試劑盒并不比直接使用儀器具有優(yōu)勢(shì)。特別是檢測(cè)農(nóng)殘的快速檢測(cè)產(chǎn)品目前還不成熟,穩(wěn)定性和假陽性等問題還未能很好解決。因此,如何同時(shí)檢測(cè)一類藥物,真正降低檢測(cè)成本,并保證檢測(cè)的準(zhǔn)確性

6、是目前農(nóng)獸藥的快速多殘留檢測(cè)的一種新趨勢(shì)。 </p><p>　　實(shí)現(xiàn)一類藥物的多殘留檢測(cè)的基本思路是針對(duì)一類藥物的共性結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)并合成半抗原,由半抗原偶聯(lián)載體蛋白制備全抗原,通過免疫動(dòng)物制備抗體,利用抗體對(duì)一類藥物的識(shí)別作用,建立多殘留檢測(cè)酶免疫分析方法[1-3]。 </p><p>　　1農(nóng)獸藥的多殘留現(xiàn)狀 </p><p>　　近年來,食品安全問題一直是困擾民生

7、的焦點(diǎn)問題,而農(nóng)獸藥殘留是制約食品安全的首要因素。2000年開始,廣東省開展食品本底水平和污染監(jiān)測(cè)項(xiàng)目,截至2005年的監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示:蔬菜甲胺磷、敵百蟲和敵敵畏檢出率分別為7.95%、3.03%和2.65%,水果有機(jī)磷農(nóng)藥水胺硫磷檢出率為10%,新鮮食用菌有機(jī)磷農(nóng)藥內(nèi)吸磷檢出率為8.33%,茶葉有機(jī)磷農(nóng)藥三氯殺螨醇檢出率為5%,蔬菜氨基甲酸酯農(nóng)藥和擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留檢出率為1.47%、17.17%,水果擬除蟲菊酯農(nóng)藥檢出率為20%。盡管

8、國家加強(qiáng)了農(nóng)藥使用的監(jiān)控力度,但是農(nóng)藥中毒事件和對(duì)外貿(mào)易摩擦仍時(shí)有發(fā)生。2008年1—2月,中日貿(mào)易過程中發(fā)生的“毒餃子”事件(有機(jī)磷農(nóng)藥中毒事件),使中國食品在日本市場(chǎng)遭受重創(chuàng)。而獸藥方面主要是一些抗生素和興奮劑的危害,如磺胺類、氟喹諾酮類、腎上腺素興奮劑等。直到2009年2月初,廣東仍有瘦肉精中毒事件發(fā)生,導(dǎo)致6~10人中毒。2009年6月1日,中華人民共和國食品安全法正式實(shí)施,表明了國家維護(hù)食品安全的力度。有了法律法規(guī)的約束作用,

9、仍然不可缺少檢測(cè)方法的支持。針對(duì)目前農(nóng)獸藥品種繁多,多殘留現(xiàn)狀嚴(yán)峻,開展多殘留檢測(cè)研究</p><p>　　2免疫分析法在各類農(nóng)獸藥多殘留檢測(cè)上的應(yīng)用 </p><p>　　農(nóng)獸藥多殘留酶免疫分析法的基本原理是根據(jù)待測(cè)一類藥物的共性結(jié)構(gòu)或共有結(jié)構(gòu)特征,設(shè)計(jì)并合成突出其結(jié)構(gòu)特征的半抗原,半抗原偶聯(lián)大分子蛋白質(zhì)作為全抗原并免疫動(dòng)物,通過細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞,收集并純化雜交瘤細(xì)胞分泌的類特異性

10、抗體(或稱寬譜特異性抗體、廣譜特異性抗體),利用抗體建立酶免疫吸附測(cè)定(ELISA)、免疫膠體金(GICA)等免疫分析法。 </p><p><b>　　2.1擬除蟲菊酯 </b></p><p>　　擬除蟲菊酯(Pyrethroids)農(nóng)藥是20世紀(jì)70年代研發(fā)的一類仿生殺蟲劑,具有化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定,不易光解,無特殊臭味及安全系數(shù)高,使用濃度低,觸殺作用強(qiáng),滅蟲速度快等

11、優(yōu)點(diǎn)。目前其酶免疫分析檢測(cè)方法的研究已經(jīng)開展比較多。Pullen等[4]直接采用氯菊酯的水解產(chǎn)物氯菊酸作半抗原,分別制備了具有不同交叉反應(yīng)率的單克隆抗體和多克隆抗體,初步探索了2種抗體的類特異性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)單克隆抗體可檢測(cè)類型Ⅰ(菊酯類)擬除蟲菊酯,對(duì)類型Ⅱ擬除蟲菊酯(氰菊酯)沒有交叉反應(yīng);而多克隆抗體既可檢測(cè)類型Ⅰ擬除蟲菊酯,又可檢測(cè)類型Ⅱ擬除蟲菊酯。Mak等[5]利用菊酸和間苯氧基芐醇合成的半抗原與甲狀腺球蛋白結(jié)合制備Ⅱ型菊酯的免疫原

12、并免疫動(dòng)物獲得多克隆抗體。由該抗體建立的ELISA方法檢測(cè)氯氰菊酯、百樹菊酯、氨氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的IC50值為6~205 ng/mL,而對(duì)Ⅰ型菊酯無交叉反應(yīng)。國內(nèi)在這方面的研究包括有李志茹[6]、駱愛蘭等[7]、楊挺等[8]、祝金鳳[9]的報(bào)道。其中祝金鳳設(shè)計(jì)合成了能模擬Ⅱ型菊酯類農(nóng)藥特征結(jié)構(gòu)的半抗原(RS)-α氰基-3-苯氧基芐基(RS)-cis,trans-2,</p><p><

13、;b>　　2.2氨基甲酸酯 </b></p><p>　　氨基甲酸酯類農(nóng)藥(Carbamate)具有殺蟲譜廣、用藥量少、藥效快等特點(diǎn),目前對(duì)其檢測(cè)主要采用高效液相色譜法和酶抑制法等,酶免疫多殘留檢測(cè)的研究報(bào)道很少。孫覃[10]合成了半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸并成功制備了芳基-N-甲基氨基甲酸酯類殺蟲劑的通用抗體,抗體檢測(cè)混滅威、滅除威、滅殺威、甲萘威的IC50值為0.47、0.65、

14、1.08、0.53 μg/mL,其中混滅威在自來水、土壤以及青菜中的添加回收率分別為101.6%、87.7%和90.4%。 </p><p><b>　　2.3有機(jī)磷 </b></p><p>　　有機(jī)磷農(nóng)藥(Organophosphorus)通常是指磷(膦)酸酯、硫逐磷酸酯、磷酰胺酯類有機(jī)磷化合物。對(duì)于有機(jī)磷農(nóng)藥的多殘留檢測(cè)通常采用的是制備類識(shí)別特異性的抗體的途徑。

15、已有的報(bào)道都是針對(duì)二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯兩大類有機(jī)磷農(nóng)藥的研究。自從1988年Sudi等[11],首先提出建立有機(jī)磷農(nóng)藥多殘留檢測(cè)的酶聯(lián)免疫的方法后,國內(nèi)外已有不少利用類特異性多克隆抗體建立二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯兩大類有機(jī)磷多殘留檢測(cè)的報(bào)道[12-17]。Jang等[18]制備了O,O-二乙基-O-(5-羧基-2-氟苯基)硫代磷酰酯作為通用半抗原,偶聯(lián)蛋白質(zhì)作為人工抗原免疫小鼠,通過細(xì)胞融

16、合體外培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞,獲得單克隆抗體,并首次利用單克隆抗體建立了間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA的方法用于有機(jī)磷多殘留檢測(cè)是一個(gè)突破。該方法對(duì)4種含有二乙氧基有機(jī)磷農(nóng)藥的IC50值在0.1~0.3 μg/mL,克服了利用多克隆抗體建立的方法特異性較差的困難。梁穎等[19]設(shè)計(jì)了3個(gè)含二甲氧基二硫代磷酸酯共有結(jié)構(gòu)的半抗原,制備出3個(gè)單克隆抗體,并建立ELISA方法,檢測(cè)馬拉硫磷、樂果、亞胺硫磷、殺螟硫</p><p><b

17、>　　2.4氟喹諾酮 </b></p><p>　　氟喹諾酮(Fluoroquinolones)類藥物是一系列新型氟取代的喹諾酮類衍生物,廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)。由于該類藥物本身帶有羧基活性基團(tuán),方便于酶免疫分析方法的應(yīng)用。蔡勤仁等[20]利用碳二亞胺法合成恩諾沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠并采用雜交瘤技術(shù)制備了類特異性單克隆抗體,與恩諾沙星、環(huán)丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、達(dá)氟沙星的交叉反

18、應(yīng)率為27.4%~110.8%,檢測(cè)限為0.13 ng/mL。魏東[21]利用活潑酯法制備了沙拉沙星人工抗原,免疫動(dòng)物得到抗血清,并建立FQNS多殘留檢測(cè)方法。該方法對(duì)沙拉沙星、諾氟沙星、環(huán)丙沙星和恩諾沙星的檢測(cè)限為19.1~26.2 ng/mL。兔肉中4個(gè)藥物在0.5~2 000.0 ng/mL范圍內(nèi)的平均添加回收率為85%。李振華[22]采用達(dá)氟沙星偶聯(lián)牛血清蛋白的人工抗原制備的兔多克隆抗體能識(shí)別達(dá)氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、氧氟沙

19、星、諾氟沙星和洛美沙星,交叉反應(yīng)率為22.7%~111.2%。王戰(zhàn)輝等[23]采用環(huán)丙沙星直接偶聯(lián)牛血清蛋白作為免疫原免疫動(dòng)物并制備得到寬譜特異性抗體單克隆抗體,該抗體建立的方法檢測(cè)12個(gè)氟喹諾酮的交叉反應(yīng)率在35</p><p><b>　　2.5磺胺 </b></p><p>　　磺胺(Sulfonamides)類藥物是一類具有廣譜抗菌活性的化學(xué)品,廣泛應(yīng)用與人和

20、動(dòng)物細(xì)菌性疾病的治療和預(yù)防。該類藥物的酶免疫多殘留檢測(cè)分析研究已經(jīng)比較多。1991年,Sheth等[24]用化學(xué)方法合成了3種具有磺胺母核結(jié)構(gòu)的半抗原TS、CS、NS,以磺胺噻唑衍生物TS偶聯(lián)蛋白作為免疫原,制備了廣譜特異性抗體。Muldoon等[25]以對(duì)氨基苯磺酸作為半抗原偶聯(lián)載體蛋白后免疫動(dòng)物,通過雜交瘤技術(shù)制備的單克隆抗體能很好識(shí)別游離藥物,檢測(cè)磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺噻唑的IC50值分別為1.41、22.80、322.00 n

21、g/mL。ZHANG Hong-yan等[26]等設(shè)計(jì)并合成了5個(gè)對(duì)氨基苯磺酸衍生物作為半抗原,其中用對(duì)氨基苯甲酸作為手臂的半抗原偶聯(lián)KLH后免疫新西蘭大白兔得到的抗體最佳。利用其建立的異源直接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法檢測(cè)11個(gè)磺胺類藥物的IC50值均小于100 ng/mL,其中磺胺異唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧噠嗪、磺胺吡啶和磺胺甲噻二唑可以滿足最高殘留限量的要求,牛奶樣品中藥物的添加回收率為104%~131%。呂芳[27]以含五元

22、雜環(huán)的磺胺類藥物為研究對(duì)象,制備了族</p><p><b>　　3展望 </b></p><p>　　目前,農(nóng)獸藥多殘留免疫分析法的應(yīng)用仍處于不成熟的階段。限制其使用的因素,一是抗藥物抗體的類特異性,二是免疫分析法本身的穩(wěn)定性和靈敏度。前者是開發(fā)農(nóng)獸藥多殘留免疫分析法的關(guān)鍵。目前的研究成果往往存在抗體譜寬足夠但特異性不強(qiáng)或譜寬較窄但特異性較好的情況,真正能達(dá)到譜寬合

23、適且特異性較好、檢測(cè)一類藥物的靈敏度相對(duì)一致的成果極少。而后者,檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和靈敏度,是開發(fā)相應(yīng)檢測(cè)試劑盒產(chǎn)品的制約因素。目前的研究主要集中在制備類特異性抗體的層面上,涉及檢測(cè)方法和試劑盒開發(fā)的研究較少。試劑盒的開發(fā)可見于一些專利,市面上銷售的試劑盒極少,更多的是處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。 </p><p>　　盡管農(nóng)獸藥多殘留免疫分析法仍不成熟,但作為低成本、高通量、快速檢測(cè)的一種檢測(cè)方法,適應(yīng)全面保證大眾食品安

24、全的時(shí)代需要,加上國家在這方面的投入,該方法有良好的發(fā)展前景。實(shí)際上,對(duì)于上述的限制因素已有一些研究報(bào)道[25-28]。對(duì)于抗體的類特異性,筆者認(rèn)為:一是可以結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬[29~30]等手段設(shè)計(jì)突出檢測(cè)對(duì)象共性結(jié)構(gòu)的半抗原,二是可以考慮用自制的樹枝狀大分子骨架定點(diǎn)、定量連接半抗原構(gòu)成全抗原。結(jié)合這兩者可以有針對(duì)性的設(shè)計(jì)合理的抗原,并使用這些抗原制備多克隆抗體或單克隆抗體。后續(xù)通過試驗(yàn)比較抗體的抗藥物譜寬和特異性,選擇譜寬和特異性都較佳

25、的抗體用于檢測(cè)方法的建立和檢測(cè)產(chǎn)品的開發(fā)。對(duì)于檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和靈敏度,筆者認(rèn)為可以借鑒開發(fā)成功的單殘留檢測(cè)試劑盒的緩沖溶液體系,同時(shí)考慮多個(gè)藥物提取液的優(yōu)化問題以提高檢測(cè)方法的穩(wěn)定性;而靈敏度方面可以結(jié)合納米技術(shù),如量子點(diǎn)技術(shù)的應(yīng)用,使檢測(cè)靈敏度有數(shù)量級(jí)的提高。 </p><p><b>　　4參考文獻(xiàn) </b></p><p>　　[1] BRUUN L,KOCH

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