農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫分析方法研究.pdf

1、有機磷類和擬煙堿類殺蟲劑是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛使用的兩類農(nóng)藥，主要用于防治水稻、玉米和蔬菜等作物上的害蟲。這兩類農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的不當使用已經(jīng)嚴重危害到環(huán)境質(zhì)量、農(nóng)產(chǎn)品安全和人類健康。因此，針對這兩類農(nóng)藥建立一種快速的、靈敏的殘留分析方法具有重要的研究意義。多殘留酶聯(lián)免疫分析技術具有操作簡便、快速，價格低廉，適宜現(xiàn)場監(jiān)控和大量樣品篩選等優(yōu)點，在農(nóng)藥殘留快速檢測中發(fā)揮著重要的作用。本研究建立了三種農(nóng)藥多殘留酶聯(lián)免疫分析方法:①應用寬譜多決定簇抗

2、體建立多殘留間接競爭酶聯(lián)免疫分析方法(ic-ELISA);②應用兩種抗體建立多殘留直接競爭酶聯(lián)免疫分析方法(dc-ELISA);③兩種抗體混用建立多殘留增強化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法(ECL-ELISA)。研究結果如下:
　　應用寬譜多決定簇抗體建立多殘留ELISA分析方法:合成對硫磷半抗原(P1)和吡蟲啉半抗原(I1)，采用碳二亞胺法將P1和I1依次與載體蛋白BSA偶聯(lián)，制備得到多決定簇人工免疫原，以多決定簇免疫原免疫雄性新西蘭大

3、白兔，獲得可同時識別對硫磷和吡蟲啉的高親和性寬譜多決定簇抗體。通過方陣滴定法篩選包被抗原和抗體的最適工作濃度，進一步研究不同包被原、有機溶劑、離子強度和pH值在ic-ELISA中對抗體親和作用的影響，確立了對硫磷和吡蟲啉ic-ELISA法的工作條件。在最優(yōu)工作條件下，建立方法的工作曲線，對硫磷ic-ELISA抑制曲線線性范圍在0.0017～1.85mg/L，回歸方程為Y=-19.785x+25.300，R2為0.9925，抑制中濃度IC

4、50為0.056mg/L，最低檢測限IC10為0.0005mg/L;吡蟲啉ic-ELISA抑制反應曲線在0.11～25.70mg/L，回歸方程Y=-25.418x+55.847，R2為0.9924，IC50為1.700mg/L，最低檢測限為0.0045mg/L。制備的抗體除了對氯噻啉有較大的交叉反應，與其他的有機磷類和擬煙堿類殺蟲劑均無明顯交叉。通過自來水、河水、土壤和甘藍中的添加回收率試驗驗證建立的ic-ELISA分析方法的準確性，添

5、加濃度為0.002～1.000mg/L(mg/kg)，添加回收率在84.4～116.9％，變異系數(shù)為0.4～7.2％。本研究建立的ic-ELISA方法符合農(nóng)藥殘留分析要求。
　　應用兩種抗體建立多殘留dc-ELISA分析方法:通過將對硫磷抗體(Pab-P)和氯噻啉抗體(Pab-I)分別包被在酶標板的不同微孔中，建立多殘留免疫分析方法。通過方陣滴定法篩選包被抗原和抗體的最適工作濃度，進一步研究不同酶標抗體、有機溶劑、離子強度和pH值

6、在dc-ELISA中對方法靈敏度的影響，確立了直接競爭酶聯(lián)免疫分析方法的最佳檢測條件。在最優(yōu)條件下，對硫磷的回歸方程為Y=-19.895x+25.291，R2為0.988，檢測范圍0.0018～1.84mg/L，IC50為0.057mg/L，最低檢測限為0.0005mg/L;甲基對硫磷的回歸方程為Y=-23.006x+32.283，R2為0.986，檢測范圍0.0084～3.42mg/L，IC50為0.169mg/L，最低檢測限為0.0

7、031mg/L;氯噻啉回歸方程Y=-20.587x+23.562，R2為0.974，線性范圍為0.0018～1.498mg/L，IC50為0.0525mg/L，最低檢測限為0.0006mg/L;吡蟲啉回歸方程Y=-19.776x+24.784，R2為0.991，IC50為0.053mg/L，最低檢測限為0.0005mg/L，線性范圍為0.0016～1.745mg/L。該方法與其他的有機磷類和擬煙堿類殺蟲劑均無明顯交叉。通過河水、土壤和甘

8、藍樣品中添加回收率對建立的方法進行準確性評估。添加濃度為0.005～0.500mg/L（mg/kg），添加回收率為82.5～116.3％，變異系數(shù)為1.6～8.1％。結果顯示，建立的dc-ELISA方法符合農(nóng)藥殘留分析要求。
　　兩種抗體混用建立多殘留ECL-ELISA分析方法:混合應用氯噻啉抗體和噻蟲啉抗體，篩選出抗體和酶標抗原的最適工作濃度，建立了應用一條標準曲線同時分析噻蟲啉和氯噻啉的化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法?；貧w方程Y=-

9、33.609x-13.252，相關系數(shù)R2為0.988，工作濃度范圍為0.0036～0.2750mg/L，最低檢測限為0.0018mg/L。為了驗證建立的ECL-ELISA分析方法的準確性，進行了番茄，甘藍和稻米的添加回收率試驗，添加濃度為0.04～0.25mg/L(mg/kg)，添加回收率在83.7～109％,變異系數(shù)為2.0～5.8％。在方法的準確性研究中，應用番茄實際樣品檢測，高效液相色譜(HPLC)結果與ECL-ELISA的結果