銀條多糖分離純化、抗腫瘤和免疫調節(jié)活性研究.pdf

1、銀條（Stachys floridana Schuttl.ex Benth）是唇形科水蘇屬多年生蓄根草本植物，分布于華北、華南和新疆等地，多處于半野生狀態(tài)。人工栽培主要集中在河南偃師，占全國栽培總量的95％以上。然而目前對銀條的研究主要涉及其繁育、栽培及貯藏保鮮等方面，而對銀條中活性物質研究開發(fā)較少，尤其多糖方面的系統(tǒng)研究幾乎沒有。鑒于此，本研究以偃師銀條為原料，分別對其多糖提取工藝及超濾濃縮、分離純化、理化性質、抗腫瘤活性和免疫調節(jié)活

2、性進行了研究。主要結果如下:
　　 1.銀條多糖提取工藝及超濾濃縮的研究
　　 選擇提取溫度、提取時間、液料比及提取次數(shù)4個因素分別進行單因素實驗，在單因素實驗基礎上，選擇提取溫度、提取時間及液料比3個參數(shù)進行三因素三水平的Box-Behnken實驗(BBD)，對此3個參數(shù)的實驗組合進行優(yōu)化，通過Design-Expert軟件對數(shù)據進行處理，得出銀條多糖的最優(yōu)提取條件為提取溫度94℃，提取時間4h，液料比19 mL/g。

3、在此條件下銀條多糖的提取率為9.98±0.60％。
　　 選擇50kDa超濾膜，以膜通量為指標，首先研究了操作壓力、超濾溫度和料液pH值3個工藝參數(shù)對銀條提取液超濾效果的影響，并在此基礎上通過正交實驗確定超濾濃縮的最佳工藝參數(shù)，最后通過測定清洗前后膜通量的變化確定最佳的超濾膜清洗方法。結果表明:最佳超濾工藝參數(shù)為操作壓力0.35 MPa，操作溫度30℃，料液pH6.5;最佳清洗方法為40℃下用pH值為8.5的NaOH溶液清洗0.

4、5 h;超濾濃縮效果優(yōu)于常規(guī)濃縮。
　　 2.銀條多糖分離純化、理化性質及初步結構分析
　　 采用DEAE-纖維素陰離子交換柱色譜法和葡聚糖G-100凝膠過濾柱色譜法對銀條多糖進行分級純化，獲得一個主要純化組分SFPSA，得率是12.57％。采用HPLC法對SFPSA的純度進行進一步鑒定，結果表明SFPSA是均一的多糖組分，其相對平均分子量為:168.30 kDa。
　　 采用苯酚硫酸法，以混合糖為標準品測定SF

5、PSA的總糖含量78.41±5.11％，比單用葡萄糖為標準品測定的結果(56.17％±3.94％)要高，而且混標法測定SFPSA中總糖含量重現(xiàn)性好，平均回收率可達97.85％，12h內結果穩(wěn)定。
　　 分別采用間羥聯(lián)苯法、氯化鋇-明膠法、考馬斯亮藍法對SFPSA中糖醛酸含量、硫酸基含量、蛋白質含量進行了測定。結果表明， SFPSA中糖醛酸含量25.20±1.88％，硫酸基含量1.98±0.21％和蛋白質含量分別為1.28±0.0

6、4％。
　　 分別采用糖腈乙?；ê蚉MP柱前衍生化法測定SFPSA單糖組成。結果表明，糖腈乙?；y定的SFPSA中含鼠李糖，阿拉伯糖，葡萄糖和半乳糖等單糖組分，其摩爾百分比為8.19∶37.74∶3.46∶50.61; PMP柱前衍生化法測定的SFPSA主要由六種單糖組成，分別是鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GlaA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gla)和阿拉伯糖(Ara)，其摩爾百分含量比為7.75

7、∶1.65∶14.92∶1.87∶33.17∶40.64，該結果說明SFPSA是一種主要由半乳糖、半乳糖醛酸和阿拉伯糖組成的雜多糖。而且，PMP柱前衍生化法能夠更加全面的反映樣品的單糖組成。
　　 紅外光譜掃描表明，SFPSA具有多糖特征吸收峰，而且具有β-吡喃糖苷鍵的特征吸收峰。紫外光譜掃描結果顯示，SFPSA在280 nm處沒有顯著的吸收峰，這表明SFPSA中蛋白質含量很低。
　　 3.銀條多糖抗結腸癌活性及其機理的

8、初步研究
　　 采用MTT法考察了SFPSA對三種腫瘤細胞株（BGC-823、HGC-27和HT-29）增殖的抑制作用，并選取其中對SFPSA最敏感的腫瘤細胞株，進一步研究SFPSA對該細胞株增殖抑制作用的機理。實驗結果表明， SFPSA能抑制這三種腫瘤細胞的增殖，且這種抑制作用均呈現(xiàn)一定的濃度和時間的依賴性。另外，給藥72 h后，SFPSA對三種腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)分別為3662.24μg/mL、1136.73μ

9、g/mL、407.52μg/mL，由此可見，人結腸癌HT-29細胞對SFPSA最為敏感。
　　 細胞形態(tài)學研究證明SFPSA可以顯著的抑制人結腸癌HT-29細胞的生長，且隨劑量的增長細胞密度逐漸下降，細胞間隙變大，失去“群集”特性，最后失去粘附性而死亡。Hoechst33258染色后，熒光顯微鏡觀察顯示其細胞核內出現(xiàn)凋亡碎片，即呈現(xiàn)顯著的凋亡特征，這表明SFPSA處理可以引起人結腸癌HT-29細胞凋亡。
　　 FITC-

10、Annexin V/PI雙染色和流式細胞儀檢測結果表明，經SFPSA處理HT-29細胞48 h后，隨著SFPSA處理濃度的增加，HT-29細胞的凋亡率從11.3±2.07％上升到47.4±0.98％。細胞周期分析結果顯示，經SFPSA處理HT-29細胞48 h后，隨著SFPSA處理濃度的增加， HT-29細胞中G0/G1期細胞比例從42.35±3.21％下降到24.38±4.01％，而G2/M期細胞比例從31.57±2.18％上升到56

11、.84±4.12％，表明SFPSA可以通過在HT-29細胞中產生G2/M阻斷，使其無法進入有絲分裂過程而促使其進入凋亡過程。
　　 采用熒光定量PCR分析SFPSA對HT-29細胞中凋亡相關基因Bax、Bcl-2和p53的mRNA表達水平的影響。結果表明，SFPSA處理HT-29細胞48 h后，隨著SFPSA處理濃度的增加，促凋亡成員Bax和p53的mRNA相對表達水平上升，與對照相比，前者分別增加了1.21倍和1.67倍，后者

12、分別增加了1.26倍和1.74倍。而抑凋亡成員Bcl-2的mRNA相對表達水平下降，與對照相比，分別下降了3.79倍和11.3倍。另外，分光光度法研究Caspase-3活化度的結果表明， HT-29細胞經SFPSA處理48 h后，細胞中Caspase-3被活化。
　　 根據以上結果，我們可以推斷SFPSA處理HT-29細胞后，可能通過上調p53表達，進而誘導Bax表達增加和Bcl-2表達減少，最后引起Caspases的級聯(lián)放大反

13、應而最終導致細胞凋亡。
　　 4.銀條多糖免疫調節(jié)活性
　　 運用體外細胞模型實驗研究了SFPSA的體外免疫調節(jié)活性。結果表明:SFPSA能促進小鼠脾淋巴細胞增殖，促其釋放IFN-γ，且能活化小鼠腹腔巨噬細胞，促其釋放免疫活性分子NO和IL-6，增強其酸性磷酸酶活性和吞噬中性紅的能力。而且SFPSA的這種體外免疫調節(jié)能力具有雙向性，即在低濃度下具有免疫促進作用，而在高濃度下則開始表現(xiàn)為不同程度的免疫抑制作用。