泥鰍多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用機(jī)理.pdf

1、泥鰍（MisgurnusangillicaudatusCantor）是我國(guó)重要的名優(yōu)經(jīng)濟(jì)魚類，屬鰍科動(dòng)物，全體和皮膚分泌的滑液可以入藥，其藥用功效收載于《中藥大詞典》。其主要功效為補(bǔ)脾益氣、消熱解毒、消痞散結(jié)、祛濕邪、治消渴、水腫黃疸、痢疾、陽痿等癥。民間常用其粘液治癰腫、中耳炎，用活泥鰍搗碎外敷治療乳癌、骨髓炎等。近代用泥鰍散治療傳染性肝炎，效果顯著。我們課題組從泥鰍粘液中分離純化得到一種泥鰍多糖，對(duì)它的結(jié)構(gòu)特征、生物活性如抗腫瘤活性

2、、免疫作用等進(jìn)行了研究，但其機(jī)理不清楚。本文在細(xì)胞水平上對(duì)泥鰍多糖的免疫調(diào)節(jié)和抗腫瘤作用的機(jī)理進(jìn)行了研究。主要結(jié)果如下：1）從小鼠中分離得到脾臟淋巴細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞，研究了泥鰍多糖對(duì)小鼠淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞增殖活性的影響，研究發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以促進(jìn)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的增殖，同時(shí)發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖的最佳作用劑量為30μg/ml。進(jìn)一步對(duì)脾臟淋巴細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞群和B淋巴細(xì)胞群研究發(fā)現(xiàn)，泥鰍多糖促進(jìn)T淋巴細(xì)胞群的增殖，而對(duì)B淋巴細(xì)胞群幾乎沒

3、有影響。應(yīng)用RT－PCR技術(shù)進(jìn)一步研究了泥鰍多糖對(duì)T淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL－2、IL－4、IL－6和IFN－γ的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖作用的靶細(xì)胞中主要是T細(xì)胞的Th1細(xì)胞亞群。泥鰍多糖可以提高巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL－6和TNF－α的表達(dá)水平，促進(jìn)iNOS的mRNA表達(dá)水平，提高的iNOS進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生NO。這些結(jié)果說明泥鰍多糖能提高免疫細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用，并且作用的靶細(xì)胞是T淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，而對(duì)B淋巴細(xì)胞沒有影響。2）為

4、了研究泥鰍多糖的抗腫瘤活性，研究了泥鰍多糖對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞株人早幼粒性白血病細(xì)胞株HL－60和人肝癌細(xì)胞株SMMC－7721的作用。應(yīng)用MTT法及檢測(cè)乳酸脫氫酶漏出率的方法研究泥鰍多糖對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以抑制腫瘤細(xì)胞HL－60和SMMC－7721細(xì)胞的增殖。細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀測(cè)泥鰍多糖可以誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡的形態(tài)學(xué)特征，提取泥鰍多糖處理的細(xì)胞DNA，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)DNA出現(xiàn)DANLadder，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)

5、發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)亞二倍體的凋亡峰，并且呈現(xiàn)出一定的濃度和時(shí)間依賴關(guān)系。這些結(jié)果說明泥鰍多糖可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，泥鰍多糖抑制腫瘤細(xì)胞的增殖主要是通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡所導(dǎo)致的。3）為了確定泥鰍多糖誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡機(jī)理，以人肝癌細(xì)胞SMMC－7721為對(duì)象，研究了泥鰍多糖對(duì)細(xì)胞線粒體的作用。先后應(yīng)用DCFH－DA熒光探針檢測(cè)泥鰍多糖對(duì)細(xì)胞活性氧的產(chǎn)生，應(yīng)用鈣離子熒光探針Fura－2/AM檢測(cè)泥鰍多糖處理的細(xì)胞內(nèi)游離鈣離

6、子濃度的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，增加細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度，并且鈣離子濃度的增加是由于胞內(nèi)鈣庫釋放的。應(yīng)用Rh－123作為熒光染料，檢測(cè)線粒體的跨膜電位變化，發(fā)現(xiàn)泥鰍多糖可以降低線粒體的跨膜電位，這些結(jié)果說明泥鰍多糖誘發(fā)腫瘤細(xì)胞的凋亡與其作用于細(xì)胞的線粒體，誘發(fā)胞內(nèi)ROS的升高，促發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣庫鈣離子的釋放，增加胞內(nèi)鈣離子濃度有關(guān)。4）應(yīng)用RT－PCR的方法研究了泥鰍多糖處理的細(xì)胞中與凋亡密切相關(guān)的基因p53、Bc

7、l－2、Bax、Fas和Fasl的mRNA的表達(dá)水平的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：泥鰍多糖可以提高p53和Bax基因的mRNA表達(dá)水平，降低Bcl－2的mRNA的表達(dá)水平，幾乎不影響Fas和Fasl的mRNA的表達(dá)水平。這些結(jié)果結(jié)合泥鰍多糖對(duì)細(xì)胞線粒體的作用說明泥鰍多糖誘導(dǎo)SMMC－7721細(xì)胞的凋亡主要是通過線粒體途徑實(shí)現(xiàn)的，與死亡受體（DR）途徑無關(guān)。5）研究了泥鰍多糖對(duì)SMMC－7721細(xì)胞NOS的活性、iNOS蛋白的表達(dá)水平以及胞內(nèi)和胞外N