重組真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因的表達(dá)及抗腫瘤作用初步研究.pdf

1、真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白(fugal immunomodulatory proteins,FIPs)是從高等擔(dān)子菌中提取的一類小分子蛋白質(zhì)。FIPs與真菌凝集素也有相似的凝集活性,能夠促進(jìn)血細(xì)胞凝集;同時(shí)還具有與人免疫球蛋白相似的結(jié)構(gòu)和免疫功能,不僅能夠促使淋巴細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子,而且具有一定的抗腫瘤活性。
　　本論文以屬內(nèi)重組新基因FIP-SN15(通過DNA shuffling技術(shù)由赤芝(Ganoderma lucid

2、um)和紫芝(Ganoderma sinense)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因重組得到)和赤芝(G. lucidum)真菌免疫調(diào)節(jié)蛋白基因 FIP-glu為材料,成功構(gòu)建了原核表達(dá)載體 pET30a-FIP-SN15和pET30a-FIP-glu,通過IPTG誘導(dǎo)蛋白在大腸桿菌(Escherichia coli) BL21細(xì)胞中高效表達(dá)了重組蛋白FIP-SN15和FIP-glu,表達(dá)量分別達(dá)到了35.95 mg/L和36.67 mg/L。通過B

3、andScan V5.0軟件分析,重組蛋白 FIP-SN15和FIP-glu分別占大腸桿菌總蛋白的51.4％和72.2%,通過Ni-NTA柱純化后2種蛋白質(zhì)的純度均達(dá)到了90%以上。通過Q-tof MS對(duì)純化的FIP-SN15蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定,得到了4條肽段,其氨基酸殘基與根據(jù)FIP-SN15核苷酸序列預(yù)測(cè)出的FIP-SN15氨基酸序列匹配率高達(dá)91.9%,證明在大腸桿菌中表達(dá)并且純化得到的分子量約為18.9kD的蛋白為重組的FIP-SN

4、15蛋白。
　　為了進(jìn)一步研究重組蛋白FIP-SN15對(duì)腫瘤細(xì)胞的毒性作用,選用人肺癌細(xì)胞 A549(Lung carcinoma)、結(jié)腸癌細(xì)胞 HT-29(Colon cancer)、肝癌細(xì)胞HCC-LM3(Hepatocellular carcinoma)和乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231(Breast adenocarcinoma)用MTT法進(jìn)行了細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),重組蛋白FIP-SN15對(duì)肺癌A549細(xì)胞和乳腺癌MDA

5、-MB-231細(xì)胞的抑制效果較好,其 IC50值分別為24.605和23.921μg/mL;對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HT-29和肝癌細(xì)胞HCC-LM3抑制情況較差,在25μg/mL以下沒有顯著的抑制作用。
　　為了研究FIP-SN15的對(duì)癌細(xì)胞的凝集活性及抗癌活性,選用人星形膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-251對(duì)重組蛋白FIP-SN15進(jìn)行細(xì)胞凝集試驗(yàn)并使用流式細(xì)胞儀(Fluorescence Activated Cell Sorter)分析其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

6、的活性和對(duì)細(xì)胞周期的影響,同時(shí)選用重組蛋白FIP-glu作為對(duì)照對(duì)上述幾種活性進(jìn)行了比較實(shí)驗(yàn)。通過reFIPs對(duì) U-251細(xì)胞的凝集試驗(yàn)證實(shí),10μg/mL的重組蛋白reFIPs即可對(duì)U-251細(xì)胞產(chǎn)生明顯的凝集作用,處理48小時(shí)后,細(xì)胞凝集成團(tuán)并脫離貼附表面。通過流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn),FIP-SN15和FIP-glu均能夠顯著抑制細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期并能夠明顯誘導(dǎo)U-251細(xì)胞的凋亡。這些結(jié)果表明, FIP-SN15能有效抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞