姬松茸多糖的分離純化與免疫調(diào)節(jié)作用研究.pdf

1、姬松茸(Agaricus brasiliensis，是一種珍稀的藥食兩用真菌，具備多種生物活性，如免疫調(diào)節(jié)，抗癌，保肝，護(hù)腎，抗糖尿病，抗氧化，抗焦慮等。研究表明，姬松茸所含多糖在其免疫調(diào)節(jié)活性方面具重要意義，其作用機(jī)理尚待進(jìn)一步研究。本論文綜合采用多種分離技術(shù)及分析手段制備姬松茸多糖并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，以小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞為研究對象，通過研究姬松茸多糖對RAW264.7細(xì)胞的增殖作用、吞噬作用、NO釋放作用、炎癥因子(IL-

2、6、IL-1β、TNF-α)、Cox-2、NF-κB、TLR4、MYD88和TRIF mRNA表達(dá)水平、IκBα蛋白磷酸化水平的影響來探究姬松茸多糖的免疫調(diào)節(jié)作用及其相關(guān)機(jī)制，以期為姬松茸多糖開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)，主要研究結(jié)果如下:
　　1.采用微波法提取姬松茸多糖，并采用大孔吸附樹脂、離子交換樹脂、分子篩色譜等方法進(jìn)行純化，最終得到姬松茸多糖樣品。采用苯酚-硫酸法測得姬松茸多糖含量為99.5％（以葡萄糖計(jì)）。高效液相色譜-蒸

3、發(fā)光散射檢測法（HPLC-ELSD法）和紫外可見吸收光譜法純度鑒定結(jié)果表明姬松茸多糖樣品純度較高。運(yùn)用排阻色譜法，根據(jù)姬松茸多糖樣品的保留時(shí)間計(jì)算得姬松茸多糖的分子量為1150KDa。
　　2.運(yùn)用HPLC柱前衍生化法確定姬松茸多糖的單糖組成，結(jié)果表明姬松茸多糖樣品的單糖組成主要為葡萄糖（占比99％以上），另外還有少量的半乳糖和甘露糖。紅外光譜顯示姬松茸多糖具有多糖的特征吸收峰，包括O-H、飽和C-H、C=O、C-H、O-H等化學(xué)

4、鍵伸縮振動的吸收峰，以及C-OH和C-O-C糖苷鍵伸縮振動引起的環(huán)振動所形成的多糖特征吸收峰，表示姬松茸多糖主要由吡喃糖組成。運(yùn)用核磁共振波譜法(1H NMR)進(jìn)一步分析姬松茸多糖的結(jié)構(gòu)，顯示姬松茸多糖主要由β構(gòu)型吡喃糖組成，并含有β-葡萄糖結(jié)構(gòu)。
　　3.MTT試驗(yàn)結(jié)果表明給藥24h和48h之后，姬松茸多糖可以明顯提高小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖率，該作用呈現(xiàn)一定的時(shí)效和量效關(guān)系。中性紅試驗(yàn)研究表明6.25μg·mL-1

5、、12.5μg·mL-1、25μg·mL-1、50μg·mL-1濃度的姬松茸多糖作用RAW264.7細(xì)胞24h和48h后，可以極顯著增強(qiáng)RAW264.7細(xì)胞的吞噬作用，吞噬率全部高于125％（以空白對照組為100％）。Griess試驗(yàn)結(jié)果表明不同濃度姬松茸多糖作用RAW264.7細(xì)胞24h和48h后，細(xì)胞NO釋放量極顯著增大，分別為3.78-7.70μM（空白為0.38μM）、15.22-17.58μM（空白為0.53μM）。上述試驗(yàn)結(jié)

6、果表明，姬松茸多糖可以促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞的增殖作用、吞噬作用、NO釋放作用，具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。
　　4.姬松茸多糖作用RAW264.7細(xì)胞24h后，炎癥因子（IL-6、IL-1β、TNF-α）和Cox-2mRNA相對表達(dá)量顯著升高，且表現(xiàn)一定的量效關(guān)系，而NF-κB、TLR4、MYD88和TRIF mRNA相對表達(dá)量無明顯變化。試驗(yàn)結(jié)果表明姬松茸多糖可能參與了NF-κB相關(guān)通路，同時(shí)通過該通路促進(jìn)炎癥因子(IL-6、I