姬松茸多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及抗腫瘤活性研究.pdf

1、姬松茸(Agaricus Blazei Murill)原產(chǎn)于北美南部、巴西和秘魯?shù)鹊?，?972年日本人工栽培獲得成功后才得以開發(fā)的一種食藥兼用的名貴真菌。姬松茸具有濃郁的杏仁香味，菌蓋嫩，菌柄脆，美味可口，含有豐富的蛋白質(zhì)和其他營養(yǎng)成分，營養(yǎng)價值很高。姬松茸更為引人注目的是其醫(yī)療保健價值，因為多糖含量高，對抑制腫瘤(尤其是腹水癌)、增強精力、防治心血管病等都有效。姬松茸的子實體、菌絲體以及發(fā)酵液中均含有活性多糖。文獻報道，姬松茸多糖具

2、有抗腫瘤、增強免疫力、降血糖、改善糖尿病、降血壓、降膽固醇、改善動脈硬化以及改善骨質(zhì)疏松等作用。由于國內(nèi)外對姬松茸多糖的研究側(cè)重于粗多糖，對其中均一多糖組分的詳細化學(xué)結(jié)構(gòu)報道較少，為系統(tǒng)研究姬松茸多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性，對姬松茸子實體中的多種多糖組分以及姬松茸菌絲體和發(fā)酵液中的多糖進行了分離純化、結(jié)構(gòu)鑒定及藥理活性研究。 本文共分六個部分，分別是子實體多糖的提取、菌絲體發(fā)酵和多糖分離純化、不同來源的姬松茸成分比較、子實體多糖的

3、分離純化、姬松茸多糖理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)分析以及各種多糖的抗腫瘤活性研究。 取得的成果如下： 1、姬松茸子實體多糖的提取工藝研究 通過單因素試驗和正交試驗，確定了較佳的提取工藝，料水比為1：30；浸提溫度：120℃；浸提時間：3h，物料浸提前用微波預(yù)處理8～12分鐘可使多糖得率從8.12％提高到9.15％。提取次數(shù)以兩次較經(jīng)濟，兩次累計提取率可達93.10％。提取液濃縮后醇沉工藝條件為3倍體積95％乙醇醇沉6h。

4、 2、姬松茸深層發(fā)酵及其多糖的提取純化研究 本章通過對姬松茸深層發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵工藝條件研究，旨在提高姬松茸菌絲體生物量以及胞外多糖的產(chǎn)量，為開展姬松茸菌絲體多糖和胞外多糖的生物活性研究打好基礎(chǔ)，也為深層發(fā)酵替代子實體栽培提供理論依據(jù)。 2.1研究了不同培養(yǎng)基成分對姬松茸深層發(fā)酵的影響，結(jié)合工業(yè)化生產(chǎn)實際，選取農(nóng)副產(chǎn)品原料玉米粉、豆餅粉為適宜的碳氮源。姬松茸深層培養(yǎng)較佳培養(yǎng)基組成為：蔗糖1％，玉米粉2％，豆餅粉0.5％

5、，KH<,2>PO<,4> 0.3％和MgSO<,4>·7H<,2>O 0.2％。 2.2研究了不同培養(yǎng)條件對姬松茸深層發(fā)酵的影響，適宜的培養(yǎng)條件為：500mL搖瓶裝液量100mL，接種量10％，轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)溫度28℃，發(fā)酵周期140h。在此最佳條件下發(fā)酵，生物量可達1.21g/100mL，胞外多糖達到0.205g/100mL。 2.3參考子實體多糖的分離純化方法，凝膠過濾法從姬松茸菌絲體中分離到兩個多

6、糖均一組分，命名為ABMM1和ABMM2，得率分別為34.5％和25.1％。 3、不同來源的姬松茸成分比較 3.1比較了姬松茸子實體和菌絲體的營養(yǎng)成分，菌絲體中總糖和蛋白質(zhì)含量略高于子實體，而子實體的灰分高于菌絲體。 3.2通過等離子發(fā)射光譜法(ICP)測定了姬松茸子實體和菌絲體中的微量元素，發(fā)現(xiàn)姬松茸菌絲體及子實體中均富含多種人體必需微量元素，尤其是鋅(Zn)和硒(Se)的含量較高。 3.3比較不同來源

7、姬松茸粗多糖中多糖和蛋白質(zhì)含量，子實體粗多糖中多糖含量高于菌絲體粗多糖，但蛋白質(zhì)含量低于菌絲體粗多糖，但經(jīng)水提工藝提取多糖，菌絲體粗多糖的得率卻略高于子實體。 3.4比較不同來源的姬松茸粗多糖的HPLC譜圖發(fā)現(xiàn)，菌絲體多糖和胞外多糖中分子量小的組分含量相對較高，而子實體粗多糖中分子量大的組分含量較高。 4、姬松茸子實體多糖的分離純化研究 本章建立了姬松茸多糖純化和分離的技術(shù)路線，主要步驟包括：超濾純化、陰陽離子交

8、換樹脂法脫蛋白、分級醇沉和凝膠過濾層析等。 4.1試驗結(jié)果表明：姬松茸多糖脫蛋白可采用如下工藝：姬松茸粗多糖溶液→1萬分子量截留率膜超濾→截留液→過陰陽離子樹脂交換柱→凍干→姬松茸脫蛋白多糖精粉。 4.2采用陰陽離子樹脂法來脫除姬松茸多糖中的蛋白質(zhì)效果相當(dāng)理想，且未見國內(nèi)外文獻報道。用弱堿性陰和弱酸性陽離子交換樹脂串聯(lián)，去離子水洗脫，條件溫和，起到部分脫色效果，用陰陽離子串聯(lián)1次，蛋白脫除率可達89.7％，多糖回收率達到

9、了82.1％。該法具有交換容量大、產(chǎn)業(yè)化放大容易、樹脂可長期反復(fù)利用、工藝簡單、生產(chǎn)成本低等諸多優(yōu)點。 4.3通過分級醇沉可以將姬松茸多糖初步分為兩個組分：命名為ABMF1和ABMF2，得率分別為48％和46％。通過Sepharose 6 F.F.凝膠過濾從ABMF1中分離得到兩個多糖均一組分：分別命名為ABMPⅠ和ABMPⅡ。 4.4通過Seplaacryl S-300凝膠過濾從ABMF2中分離得到一個多糖均一組分，命

10、名為ABMPⅢ，ABMPⅢ的含量為ABMF2的28.6％。 5、姬松茸子實體多糖單組分結(jié)構(gòu)分析 5.1 姬松茸子實體多糖均一組分ABMP Ⅰ為白色固體，ABMP Ⅱ為微黃色固體，二者都易溶于水，它們的旋光度分別為+62.5°，+44.3°，分子量分別為>20×10<'5>，14×10<'5>。 5.2完全酸水解結(jié)合HPLC檢測確定均一組分ABMP Ⅰ和ABMP Ⅱ都僅由葡萄糖單元組成。 5.3 ABMP

11、Ⅰ是以1，4連接的吡喃型葡萄糖為主鏈并含有少量結(jié)合蛋白(1.5％)的非淀粉α葡聚糖。 5.4 ABMP Ⅱ可能是含有β-吡喃型葡萄糖基的蛋白聚糖。 6、姬松茸多糖的抗腫瘤活性研究 6.1姬松茸多糖ABMPⅠ、ABMP Ⅱ灌胃給藥，對小鼠S180實體瘤均有一定的抑瘤作用，其中ABMPⅠ的抑瘤作用較ABMlPⅡ好。兩個組分對小鼠S180實體瘤的抑制都呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性，灌胃劑量為200 mg/kg·d時，ABMPⅠ的抑

12、瘤率為46.3％；ABMPⅡ的抑瘤率為38.7％。 6.2姬松茸多糖ABMPⅠ、ABMPⅡ灌胃給藥，對小鼠肝癌腹水實體瘤有較好的的抑瘤作用，其中ABMPⅠ的抑瘤作用較ABMPⅡ好。兩個組分對小鼠肝癌腹水實體瘤的抑制都呈現(xiàn)出劑量相關(guān)性，灌胃劑量為200 mg/kg·d時，ABMPⅠ的抑瘤率為53.4％；ABMPⅡ的抑瘤率為40.1％。 6.3通過灌胃給藥，姬松茸菌絲體粗多糖和姬松茸胞外多糖對小鼠S180實體瘤都有較好的抑制