土茯苓中性雜多糖的分離純化、結(jié)構(gòu)解析及其免疫調(diào)節(jié)作用的研究.pdf

1、目的:
　　1.優(yōu)選土茯苓粗多糖的脫色材料并獲得其最佳脫色工藝參數(shù)。
　　2.從土茯苓中得到純度較高、相對(duì)分子質(zhì)量均一的中性雜多糖，并對(duì)其理化性質(zhì)和初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行考察解析。
　　3.探討土茯苓中性雜多糖對(duì)巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。
　　方法:
　　1.以脫色率和多糖保留率為考察指標(biāo)，通過(guò)靜態(tài)吸附法從6種不同的樹(shù)脂中優(yōu)選出脫色效果最佳的樹(shù)脂;隨后通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)考察其上樣量、脫色pH、脫色溫度、脫色時(shí)間、脫

2、色轉(zhuǎn)速分別對(duì)脫色率、多糖保留率的影響。在單因素的基礎(chǔ)上，采用四因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，建立并分析了各因素分別與脫色率、多糖保留率之間的數(shù)學(xué)模型。
　　2.土茯苓通過(guò)熱水提取得到土茯苓中性粗多糖，乙醇醇沉、Sevage法脫蛋白及XAD-16型樹(shù)脂脫色素等方法去除粗多糖中的非糖雜質(zhì)，并采用離子交換DEAE FASTFLOW層析柱和Superdex-200凝膠層析柱進(jìn)行進(jìn)一步的分離純化得到一土茯苓中性多糖。
　

3、　3.采用紫外光譜掃描、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量、硫酸-苯酚法檢測(cè)總糖含量、TG熱分析、元素分析等方法對(duì)土茯苓中性多糖的物理性質(zhì)進(jìn)行考察。
　　4.通過(guò)相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定、單糖組成測(cè)定、高碘酸氧化、Smith降解、甲基化、紅外分析、核磁共振分析等方法對(duì)土茯苓中性多糖的初級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。
　　5.通過(guò)MTT法檢測(cè)土茯苓中性雜多糖對(duì)巨噬細(xì)胞活力的影響。
　　6.通過(guò)中性紅實(shí)驗(yàn)檢測(cè)巨噬細(xì)胞的吞飲作用，利用熒光酶標(biāo)儀和流式細(xì)胞

4、儀檢測(cè)吞噬異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的大腸桿菌(E.coli)的功能，并在倒置熒光顯微鏡進(jìn)行拍照觀察，考察土茯苓中性雜多糖對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬功能的影響。
　　7.采用ELISA試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清中分泌細(xì)胞因子的含量;利用一氧化氮試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清中NO的含量;通過(guò)PCR-RT方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞中TNF-α、IL-6和iNOS的基因表達(dá);通過(guò)Western方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞JNK和ERK1/2蛋白的表達(dá)情況，考察土茯苓中性雜多糖

5、對(duì)巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　8.利用ELISA試劑盒檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清中IL-1β的含量;通過(guò)DAPI細(xì)胞染核，采用激光掃描共聚焦顯微鏡(CLSM)共定位巨噬細(xì)胞中的NLRP3和ASC蛋白表達(dá);通過(guò)Western方法檢測(cè)巨噬細(xì)胞NLRP3蛋白的表達(dá)情況，考察土茯苓中性雜多糖對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌IL-1β的影響及其可能的作用機(jī)制。
　　9.利用中和抗體Anti-TLR2、Anti-TLR4、Ant

6、i-CR3、Anti-MR、Anti-SR和Anti-GR分別抑制RAW264.7細(xì)胞表面相應(yīng)受體，再給予土茯苓中性雜多糖進(jìn)行干預(yù)，檢測(cè)細(xì)胞上清液中細(xì)胞因子IL-6和TNF-α的表達(dá)量，考察巨噬細(xì)胞膜受體對(duì)土茯苓中性雜多糖免疫活性的影響。
　　10.綜合所有的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)土茯苓中性雜多糖SGRP1對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)活性的可能機(jī)制進(jìn)行總結(jié)和推斷。
　　結(jié)果:
　　1.利用XAD-16型大孔樹(shù)脂進(jìn)行土茯苓粗

7、多糖脫色的最佳工藝條件為:粗多糖溶液的pH為5、溫度47.02℃、溶液用量6.0mL、轉(zhuǎn)速110r/min脫色時(shí)間1.8h，在此條件下的脫色率和保留率分別為80.07％、73.52％，可獲得較好色澤的粗多糖。
　　2.土茯苓經(jīng)“水提醇沉法”提取得到水溶性中性粗多糖，經(jīng)DEAE FF離子交換柱和Superdex G-200凝膠柱層析純化后，得到一土茯苓中性多糖(SGRP1)組分。
　　3.SGRP1是一種白色絲絨狀固體，無(wú)味，

8、易溶于水，不溶于有機(jī)溶劑，其元素組成主要是氮0.02％、碳38.36％、氫6.561％。SGRP1組分中無(wú)核酸和蛋白質(zhì)物質(zhì)存在，其熱降解峰值為310.46℃，對(duì)熱穩(wěn)定性好。
　　4.SGRP1的化學(xué)結(jié)構(gòu)解析結(jié)果顯示:SGRP1是一種相對(duì)分子質(zhì)量均一的雜多糖，其分子量為1.26×104Da，由甘露糖、巖藻糖、葡萄糖三種單糖按照摩爾比1.00∶3.09∶39.41組成。SGRP1相鄰單糖殘基之間的連接的主要糖苷鍵類型有1→4、1→3和

9、1-→6鍵等。此外，SGRP1中含有Ⅱ型吡喃糖，其單糖殘基的類型包括(1→3)-α-L-巖藻糖，(1→3)-α-D-甘露糖，（1→）-α-D-葡萄糖，(1→6)-α-D-葡萄糖。
　　5.SGRP1在濃度為0-500μg/mL范圍內(nèi)，對(duì)巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)無(wú)明顯影響(P＞0.05)。
　　6.SGRP1可明顯促進(jìn)巨噬細(xì)胞吞噬中性紅和FITC標(biāo)記的大腸桿菌，增強(qiáng)小鼠腹腔巨噬細(xì)胞RAW264.7的吞噬功能。
　　7.SGRP1具

10、有促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌NO、IL-6和TNF-α的作用，呈濃度依賴性;該活性的分子機(jī)制與提高巨噬細(xì)胞iNOS、IL-6和TNF-α的基因表達(dá)，通過(guò)以及上調(diào)JNK和ERK1/2蛋白的表達(dá)有關(guān)。
　　8.SGRP1能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子IL-1β，增加巨噬細(xì)胞中的NLRP3炎性小體成分NLRP3和ASC蛋白的表達(dá)與共定位，并上調(diào)巨噬細(xì)胞中NLRP3蛋白的表達(dá)量，這些數(shù)據(jù)表明SGRP1促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞分泌炎癥因子IL

11、-1β的作用與通過(guò)激活巨噬細(xì)胞內(nèi)的NLRP3炎性小體密切相關(guān)。
　　9.SGRP1可顯著降低多種中和抗體作用預(yù)處理的巨噬細(xì)胞上清液中IL-6和TNF-α的分泌(P＜0.01)，其中TLR2處理組的表達(dá)量最低，說(shuō)明小鼠腹腔巨噬細(xì)胞上的模式識(shí)別受體TLR2、TLR4、CR3、MR、SR和GR均可識(shí)別土茯苓中性雜多糖SGRP1，而TLR2是其最主要的模式識(shí)別受體。
　　10.SGRP1在體外實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的免疫調(diào)節(jié)活性，其可能機(jī)

12、制是:一方面，SGRP1能夠非特異性地與RAW264.7細(xì)胞上以TLR2為主的多種膜表面受體相互作用，將傳導(dǎo)信號(hào)至細(xì)胞內(nèi)分別激活JNK、ERK1/2信號(hào)通路和NLRP3炎性小體，增強(qiáng)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄而促進(jìn)一系列免疫因子(NO、IL-6、TNF-α和IL-1β)的分泌。另一方面，SGRP1可能經(jīng)甘露糖受體(MR)將信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)促進(jìn)溶酶體的形成，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞的吞噬功能而參加巨噬細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)。
　　結(jié)論:
　　本課題研究結(jié)果表明