法氏囊五肽的分離鑒定及其免疫調(diào)節(jié)和抗過(guò)氧化應(yīng)激機(jī)理的研究.pdf

1、法氏囊是禽類特有的中樞免疫器官,是B細(xì)胞分化發(fā)育和成熟的場(chǎng)所。法氏囊超濾液(1KDa以下)含有許多生物活性物質(zhì),特別是一些小肽不僅對(duì)禽類具有免疫調(diào)節(jié)功能,而且對(duì)哺乳動(dòng)物及人類淋巴細(xì)胞也有明顯的免疫學(xué)及生理學(xué)活性。近年來(lái),對(duì)法氏囊活性肽的研究雖然取得了一定的進(jìn)展,但對(duì)法氏囊活性肽的認(rèn)識(shí)還有很多空白,關(guān)于它們的生物學(xué)特性及功能等方面還有很多值得研究的地方。雖然,禽法氏囊在體液免疫中起調(diào)節(jié)作用,但還對(duì)細(xì)胞免疫反應(yīng)的調(diào)節(jié)膀?qū)?yīng)具有重要的功能。

2、文獻(xiàn)所報(bào)道的法氏囊小肽如,囊素三肽(Lys-His-Gly-Amide)、法氏囊肽-1(Tyr-Glu—Glu)、法氏囊肽-2(Trp-Thr—Ala-Glu-Glu-Lys—Gln-Leu)及法氏裳七肽(BSP—Ⅱ,TPSGLVY)等,雖然都對(duì)B細(xì)胞或體液免疫產(chǎn)生影響,但它們各自也有不同的功能。事實(shí)上,代謝過(guò)程、免疫和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間有相互的作用,影響機(jī)體的生理動(dòng)態(tài)平衡。因此,雖然從免疫學(xué)觀點(diǎn)研究法氏囊活性肽,了解其在禽法氏囊中的免

3、疫學(xué)特性是必需的,但對(duì)法氏囊活性肽的其他功能的研究同樣也是很重要的。由于法氏囊重要的免疫調(diào)節(jié)活性以及法氏囊提取物具有廣泛的生物學(xué)活性,因此,對(duì)法氏囊中新的活性物質(zhì)的研究具有非常廣闊的領(lǐng)域和實(shí)際應(yīng)用的廣泛意義,同時(shí),對(duì)于深入了解法氏囊的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理及其他生理功能具有重要的理論意義。
　　 本研究,充分利用當(dāng)代先進(jìn)的生物技術(shù)及分析手段,從雞的法氏囊中提取到一種新的活性五肽:法氏囊五肽(Bursopentine,BP5)。通過(guò)研究法氏

4、囊五肽聯(lián)合禽流感滅活疫苗免疫雞和小鼠來(lái)評(píng)價(jià)其免疫調(diào)節(jié)活性并對(duì)其免疫調(diào)節(jié)機(jī)理進(jìn)行探討。另外,通過(guò)體外化學(xué)模擬的方法以及巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激模型對(duì)其抗氧化活性和抗過(guò)氧化應(yīng)激的機(jī)理展開了研究。本研究主要從以下幾個(gè)方面展開:
　　 1法氏囊五肽的分離、純化和鑒定
　　 法氏囊是禽類特有的免疫器官,是B細(xì)胞分化發(fā)育和成熟的場(chǎng)所,其提取物中含有多種活性物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)活性。本試驗(yàn)以雞法氏囊為原料,通過(guò)勻漿、凍融、超濾和反相高效液相

5、色譜(RP-HPLC)等步驟,分離純化得到了一種新的活性肽:法氏囊五肽(Bursopentine)。從500 g新鮮的雞法氏囊組織中純化到了4.82 mg的法氏囊五肽。經(jīng)Edman降解法和ESI-Q-TOF-MS質(zhì)譜分析,獲得了完整的法氏囊五肽氨基酸序列:Cys—Lys-Asp-Val-Tyr,并測(cè)知其分子量為626.27 Da。
　　 2法氏囊五肽在雞體內(nèi)的免疫學(xué)活性研究
　　 為探討法氏囊五肽的免疫調(diào)節(jié)活性,6周齡白

6、來(lái)航雞隨機(jī)分為5組,每組30只。用合成的法氏囊五肽(BP5)和H9N2禽流感滅活病毒(AIV)混合后分別以肌肉接種的方式給雞進(jìn)行2次免疫,同時(shí)設(shè)兩組對(duì)照組雞,分別免疫PBS和滅活的H9N2 AIV。最后一次免疫后1周攻毒。然后通過(guò)測(cè)定血清 HI效價(jià)、Th1和 Th2類型細(xì)胞因子分泌水平、淋巴細(xì)胞增殖來(lái)評(píng)價(jià)BP5對(duì)機(jī)體免疫功能的影響。同時(shí)以攻毒保護(hù)力來(lái)評(píng)價(jià)BP5作為分子佐劑的免疫調(diào)節(jié)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,BP5能夠顯著提高機(jī)體的抗原特異性抗

7、體(HI抗體)；顯著提高AIV抗原免疫雞的細(xì)胞因子IFN-γ和IL-4的分泌水平；能有效促進(jìn)AIV抗原免疫雞的血液淋巴細(xì)胞的增殖。雞攻毒后肺臟病毒含量檢測(cè)顯示,BP5有助于AIV抗原免疫雞肺臟病毒的清除。以上結(jié)果顯示BP5通過(guò)介導(dǎo)體液和細(xì)胞免疫反應(yīng),顯著提高了雞的抗原特異性免疫保護(hù)作用,證明其具有良好的免疫調(diào)節(jié)活性。
　　 3法氏囊五肽免疫調(diào)節(jié)機(jī)理的研究
　　 為了進(jìn)一步研究法氏囊五肽的免疫調(diào)節(jié)機(jī)理,4-6周齡小鼠隨機(jī)分

8、為6組,每組30只。用不同劑量合成的法氏囊五肽(BP5)與H9N2禽流感滅活病毒(AIV)混合后分別以肌肉接種的方式給小鼠進(jìn)行3次免疫,同時(shí)設(shè)兩組對(duì)照組小鼠,分別免疫PBS和常規(guī)滅活疫苗。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,BP5提高了特異性HA抗體(IgG抗體及其亞型IgG1和IgG2a)的水平,增強(qiáng)了Th1型(IL-2和干擾素-γ)和Th2型(IL-4和-10)細(xì)胞因子的分泌,促進(jìn)了脾淋巴細(xì)胞亞群CD4+T細(xì)胞(CD3+CD4+)、CD8+T細(xì)胞(CD3

9、+CD8+)和B細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)了細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)對(duì)NIH3T3細(xì)胞的殺傷活性。進(jìn)一步的研究表明,BP5具有直接激活B細(xì)胞而間接增加T細(xì)胞增殖的活性；而BP5誘導(dǎo)的B淋巴細(xì)胞增殖是由BP5本身巰基自氧化生成的活性氧介導(dǎo)的。此外,本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)還表明,BP5通過(guò)信號(hào)通路PKC,p38 MAPK和NF—κB發(fā)揮誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞增殖的作用。這項(xiàng)研究顯示,BP5或可作為一種新的強(qiáng)效免疫調(diào)節(jié)劑或免疫增強(qiáng)劑應(yīng)用于藥物或疾病控制。
　　

10、 4法氏囊五肽體外抗氧化活性研究
　　 為了進(jìn)一步了解法氏囊五肽的其它生理功能,在體外無(wú)細(xì)胞系統(tǒng),對(duì)其抗氧化功能進(jìn)行了研究。由于法氏囊五肽是一種新的含巰基的活性肽,而很多含巰基的物質(zhì)具有抗氧化作用,故法氏囊五肽在理論上存在抗氧化活性的可能。本研究應(yīng)用體外化學(xué)模擬的方法證明了法氏囊五肽具有較強(qiáng)的抗氧化活性,包括較強(qiáng)的還原能力,很好的金屬螯合能力以及極強(qiáng)的清除自由基的活性,包括清除超氧自由基(O2-)和羥自由基(OH)的活性。實(shí)驗(yàn)

11、證明,法氏囊五肽是一種天然的抗氧化劑,具有極好的開發(fā)應(yīng)用前景。
　　 5法氏囊五肽抗過(guò)氧化應(yīng)激活性及其機(jī)理的研究
　　 為了進(jìn)一步驗(yàn)證法氏囊五肽在活細(xì)胞中的抗過(guò)氧化活性,本實(shí)驗(yàn)利用LPS誘導(dǎo)的活細(xì)胞過(guò)氧化應(yīng)激模型對(duì)此展開了研究。在LPS激活的小鼠腹腔巨噬細(xì)胞中,BP5顯著地抑制了活性氧(ROS)和一氧化氮(NO)的產(chǎn)生,降低了脂質(zhì)過(guò)氧化水平以及抑制誘導(dǎo)型一氧化氮合成酶(iNOS)的活性。在活細(xì)胞中,BP5顯示了良好的抗過(guò)

12、氧化活性。為了探討B(tài)P5這種抑制細(xì)胞過(guò)氧化應(yīng)激的機(jī)制,本試驗(yàn)研究了BP5對(duì)細(xì)胞自由基清除系統(tǒng),特別是對(duì)谷胱甘肽(GSH)氧化還原循環(huán)及抗氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,BP5提升了細(xì)胞抗氧化還原保護(hù)狀態(tài),包括提高了細(xì)胞GSH含量以及提高了一些重要的酶系統(tǒng),其中包括谷胱甘肽過(guò)氧化酶,谷胱甘肽還原酶,超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶等的活性。為了進(jìn)一步了解BP5這種抑制氧化應(yīng)激機(jī)制的基礎(chǔ),本實(shí)驗(yàn)研究了BP5對(duì)細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)水