DEB通過氧化應(yīng)激誘導雄性生殖細胞DNA損傷和周期阻滯的研究.pdf

1、目的:
　　1，3-丁二烯（1,3-Butadiene，BD）被廣泛應(yīng)用于合成尼龍、塑料、橡膠等產(chǎn)品，其作為一種重要的化工原料不僅引起職業(yè)人群的健康損害，同時因其在汽車尾氣、香煙煙霧及食用油煙中普遍存在被認定居民住宅環(huán)境區(qū)的主要污染物之一。國際癌癥研究組織(IARC)也于2008年認定BD為一級致癌物。它的活性中間代謝產(chǎn)物1，2，3，4-二環(huán)氧丁烷（1,2,3,4-diepoxybutane，DEB）具有較強的基因毒性，可以導致遺

2、傳物質(zhì)發(fā)生損傷。但其對雄性生殖細胞的損傷與周期阻滯之間的關(guān)系及相關(guān)機制有待進一步闡明。
　　方法:
　　給予100，300，500μM DEB處理GC-2細胞（小鼠精母細胞），采用cck-8和EdU實驗檢測細胞增殖情況。運用流式細胞儀檢測 GC-2細胞內(nèi)活性氧(ROS)含量以及DEB對GC-2細胞周期和凋亡的影響。通過吉姆薩染色法檢測GC-2細胞有絲分裂指數(shù)。運用堿性彗星實驗、胞質(zhì)阻滯分裂微核實驗、western blot方

3、法分析DEB處理后GC-2細胞的損傷情況。應(yīng)用western blot檢測細胞周期信號通路Chk1/Cdc25c/Cdc2/CyclinB1蛋白表達及其磷酸化的變化情況。運用免疫熒光法檢測CyclinB1在GC-2細胞胞核中的分布。在以上方法的基礎(chǔ)上，提前1h給予10 mM抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸（NAC）處理，分析DEB處理后NAC對GC-2細胞 ROS含量、?-H2AX蛋白的表達、G2/M周期分布及細胞周期關(guān)鍵調(diào)控分子p-Chk1、

4、p-Cdc25c蛋白的影響。提前4h給予Chk1蛋白激酶抑制劑UCN-01處理，觀察DEB處理后UCN-01對GC-2細胞周期分布及周期關(guān)鍵調(diào)控分子p-Chk1、p-Cdc25c、p-Cdc2的表達情況。為了進一步驗證Chk1的重要性，給予Chk1 siRNA檢測G2期關(guān)鍵調(diào)控蛋白分子磷酸化蛋白的表達情況。同時，我們在小鼠動物體內(nèi)驗證了DEB對生殖細胞周期的影響。選取24只健康成年昆明小鼠（10-12周）適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，隨機分成4組，

5、于第1、3、5天腹腔注射不同劑量的DEB（0、17、34.5、85mg/kg）。在首次染毒后第7天小鼠被處死，采用流式細胞術(shù)、組織病理學技術(shù)（HE染色）、免疫組織化學法檢測DEB對小鼠睪丸細胞DNA含量分布、小鼠睪丸形態(tài)學的改變及周期蛋白在小鼠睪丸組織中的表達情況，采用計算機精液輔助分析儀(CASA)檢測DEB對小鼠精液參數(shù)的改變，通過南京試劑盒檢測小鼠肝臟丙二醛（MDA）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）及超氧化物歧化酶（SOD）的

6、含量。
　　結(jié)果:
　　研究發(fā)現(xiàn)，DEB處理后可抑制GC-2細胞的增殖，進而通過流式細胞術(shù)觀察到 DEB處理組 G2/M期比例顯著高于對照組（p<0.05）但無凋亡的發(fā)生,表明DEB可誘導GC-2細胞發(fā)生G2/M期阻滯。流式分析發(fā)現(xiàn)，DEB處理組中DCF平均熒光強度要明顯高于對照組（p<0.05），提示DEB可誘導GC-2細胞內(nèi)ROS含量增加。熒光顯微鏡下觀察DEB處理組GC-2細胞彗星的Tail Length、Tail D

7、NA％、Tail Moment值均明顯高于對照組（p<0.05）,westen blot結(jié)果顯示，與對照組相比，隨著DEB的增加，γ-H2AX蛋白表達水平顯著增加，胞質(zhì)阻滯分裂微核實驗發(fā)現(xiàn)，微核、核質(zhì)橋、核芽突率明顯高于對照（p<0.05），這些結(jié)果提示DEB可以誘導GC-2細胞發(fā)生DNA損傷。同時，吉姆薩染色顯示，DEB處理后有絲分裂指數(shù)顯著增加，免疫熒光法顯示CyclinB1在GC-2細胞核內(nèi)的表達逐漸減少，western blot

8、結(jié)果顯示，DEB處理后可上調(diào)ATM/Chk1信號通路P-ATM、P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2、CyclinB1的蛋白表達水平，下調(diào)有絲分裂期標志蛋白p-H3的表達，提示DEB處理后可誘導GC-2細胞G2期阻滯。為了探討氧化應(yīng)激參與了DEB的生物效應(yīng)，在給予NAC處理后發(fā)現(xiàn)ROS含量明顯下降，γ-H2AX蛋白表達水平被下調(diào)，NAC+DEB處理組G2期比例較與DEB處理組顯著降低（p<0.05），而且NAC可以部分逆轉(zhuǎn)DEB

9、對p-Chk1、p-Cdc25c蛋白表達的抑制作用，從而緩解G2期阻滯。為了檢測Chk1在G2期的重要性，給予chk1蛋白酶抑制劑UCN-01處理后發(fā)現(xiàn)UCN-01+DEB處理組G2期比例較DEB處理組顯著降低（p<0.05），且UCN-01+DEB處理組較DEB處理組可下調(diào)P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水平。同時chk1 siRNA+DEB處理組較DEB處理組也可下調(diào)P-Chk1、P-Cdc25c、P-Cdc2蛋白水

10、平，提示Chk1在G2期發(fā)揮了重要的作用。在DEB腹腔注射小鼠的體內(nèi)實驗中，小鼠精子畸形率顯著增加，精子活動力減弱，HE染色結(jié)果提示，DEB處理組與對照組比較，小鼠睪丸細胞有空泡及固縮的核形成，曲細精管排列紊亂，精子細胞層數(shù)減少及空管的形成。流式結(jié)果顯示，與對照組相比，各劑量染毒組的四倍體細胞比例顯著提高（p<0.05）。免疫組化結(jié)果顯示，DEB處理組中小鼠睪丸p-H3蛋白表達平均光密度值逐漸減少，P-Chk1蛋白表達的平均光密度值較對