2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景:阿爾茨海默?。ˋD)是老年人常見的疾病之一,嚴重影響人類的身心健康,給患者家庭及社會帶來了沉重的負擔(dān)。近年來越來越多的研究顯示,2型糖尿病與AD的發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān),Luchsinger等對1262名老年人群調(diào)查顯示1/3的癡呆與糖尿病有關(guān),相關(guān)流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),DM患者發(fā)生AD的危險性是非DM患者的2倍。糖尿病導(dǎo)致AD發(fā)生的機制與胰島素細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)異常、高膽固醇血癥及高血糖狀態(tài)下非酶糖基化反應(yīng)生成的糖基化終末產(chǎn)物(advan

2、ced glycation end products,AGEs)有關(guān)。糖的醛基和蛋白質(zhì)的氨基經(jīng)過復(fù)雜的非酶糖基化反應(yīng)(Maillard反應(yīng))生成一類不可逆聚合物,即糖基化終末產(chǎn)物,AGEs在糖尿病視網(wǎng)膜病變、動脈硬化、糖尿病腎病等靶器官損害中發(fā)揮重要作用,而AD患者腦內(nèi)老年斑和神經(jīng)元纖維纏結(jié)中均發(fā)現(xiàn)有AGEs的聚積,Takeuchi和Maczurek等研究也指出,AGEs在糖尿病所致的認知功能障礙和AD病理變化中起著非常重要的作用,是引

3、起老年人認知功能下降的危險因素之一。AGEs能夠促進蛋白的聚積與交聯(lián),直接抑制蛋白的正常功能,并能夠通過促進活性氧(reative oxygen species,ROS)的產(chǎn)生對機體造成生物損傷,除此之外還能與其特異性受體(主要是RAGE)結(jié)合進而通過一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮其間接毒性作用。
   AD的典型病理改變是在特定腦區(qū)內(nèi)出現(xiàn)老年斑(senile plaques,SPs)、神經(jīng)元纖維纏結(jié)(neurofibrillaryta

4、ngles,NFFs)、神經(jīng)元及突觸丟失。神經(jīng)元進行性減少是AD的重要病理特征,其中,細胞凋亡起了主導(dǎo)作用。凋亡是程序性的細胞死亡過程,外源性死亡受體途徑、內(nèi)源性線粒體凋亡通路以及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)的細胞凋亡過程目前是公認的細胞凋亡的主要通路,近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激性凋亡途徑在多種疾病如糖尿病、腦梗塞、阿爾茨海默病的發(fā)病中扮演了重要角色,我們以往研究提示AGEs參與APP異常代謝及AB的生成,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是生成Aβ1-42的主要場所,在APP

5、的代謝中起著重要作用。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊功能障礙、鈣平衡的破壞及氧化反應(yīng)的異常等都會觸發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。AGEs是否通過觸發(fā)氧化應(yīng)激及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激進而導(dǎo)致細胞凋亡參與AD發(fā)生發(fā)展尚不清楚,為此,我們設(shè)計該課題,選擇非常接近正常神經(jīng)細胞形態(tài)及生理功能的入神經(jīng)母細胞瘤細胞株SH-SY5Y,以此為研究對象,以非酶糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-bovine serum albumin,AGE-BSA)處理細胞,并分別以抗RAGE中和抗體

6、(RAGE-antibody,RAGE-Ab)、抗氧化劑α-硫辛酸(alpha lipoic acid, ALA)及NADPH氧化酶抑制劑二亞苯基碘(diphenyleneiodonium,DPI)預(yù)處理細胞探討AGEs是否通過氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促進細胞凋亡,揭示AGEs參與阿爾茨海默病發(fā)生發(fā)展的可能相關(guān)機制。
   目的:本實驗通過研究AGEs對體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞凋亡的影響及氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在該過程中的作用,探

7、討AGEs參與AD發(fā)生發(fā)展的可能機制。
   方法:選擇體外培養(yǎng)的SH-SY5Y細胞為模型,分別以不同濃度(0、50、100、200、300μg/mL)的糖基化修飾的牛血清白蛋白(AGE-BSA)處理SH-SY5Y細胞48h,選取AGE-BSA敏感濃度200μg/mL處理細胞不同時間(24、36、48h),流式細胞儀(FCM)分別檢測各組細胞凋亡率,確定AGE-BSA誘導(dǎo)SH-SY5Y凋亡最佳濃度及時間:將細胞隨機分為6組:正常

8、對照組、BSA對照組(200μg/mL BSA)、AGE-BSA組(200μg/mLAGE-BSA)、AGE-BSA+RAGE-Ab組:預(yù)先用抗RAGE-Ab(10μg/mL)干預(yù)細胞1h,再加入AGE-BSA(200μg/mL);AGE-BSA+ALA組:預(yù)先用ALA(終濃度200μmol/L)干預(yù)細胞1h,再加入AGE-BSA(200μg/mL);AGE-BSA+DPI組:先加DPI(30nmol/L)干預(yù)1h,加入AGE-BSA(

9、200μg/mL)。處理48h后FCM檢測各組細胞凋亡率,Hoechst33258熒光染色觀察凋亡細胞核形態(tài)變化;應(yīng)用活性氧熒光探針DCFH-DA檢測AGE-BSA干預(yù)SH-SY5Y細胞不同時間(0、12、24、48h)后活性氧(ROS)水平,及不同藥物處理48h后細胞ROS水平;通過免疫細胞熒光化學(xué)及免疫蛋白印跡方法觀察AGEs處理細胞不同時間(0、12、24、48h)后GRP78、p-eIF2α、Caspase-12的蛋白表達情況;

10、選取各蛋白表達高峰時間點,應(yīng)用免疫蛋白印跡方法檢測各不同處理組SH-SY5Y細胞內(nèi)GRP78、p-eIF2α、 Caspase-12蛋白表達變化。
   結(jié)果
   1.FCM測細胞凋亡率
   1.1正常細胞凋亡率為(2.23±0.08)%,50、100、200、300μg/mLAGE-BSA作用48 h后凋亡率分別為(2.98±0.67)%、(8.23±0.42)%、(16.8±1.27)%、(19.6±2.

11、89)%;200μg/mL AGE-BSA作用24、36、48 h后凋亡率分別為(7.54±1.08)%、(10.75±1.19)%、(16.8±1.27)%,提示AGE-BSA能誘導(dǎo)細胞凋亡,且凋亡率隨AGE-BSA濃度增加及時間延長而增高。
   1.2分別用RAGE中和抗體、ALA、DPI預(yù)處理細胞后再加入AGE-BSA200μg/mL作用48 h,細胞凋亡率分別為(5.18±0.16)%、(5.94±0.10)%、(7.

12、26±1.22)%,與AGE-BSA組相比凋亡率分別下降69.1%、64.6%、56.8%,差異顯著(P<0.01或P<0.05),BSA對照組與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
   2.Hoechst33258熒光染色觀察凋亡細胞核形態(tài):不同處理組細胞經(jīng)Hoechst33258染色在熒光顯微鏡下觀察形態(tài),正常對照組和BSA對照組細胞核呈彌散均勻的藍色熒光,無核濃聚,AGE-BSA組可見大量散在凋亡樣改變的細胞核,表現(xiàn)為亮藍色

13、,出現(xiàn)核碎裂,熒光強度比正常細胞明顯增強,抗RAGE-Ab、ALA、DPI預(yù)處理組均可見細胞熒光強度比AGE-BSA組降低,凋亡細胞數(shù)明顯減少。
   3.DCFH-DA檢測SH-SY5Y細胞ROS水平
   3.1 AGE-BSA干預(yù)0h的細胞內(nèi)僅有少量ROS,AGE-BSA干預(yù)細胞12h可見細胞內(nèi)ROS水平顯著升高,接近0h組細胞的4倍,并且隨AGE-BSA作用時間的延長,ROS水平不斷增高,與0h組細胞比較差異具有

14、統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。
   3.2 AGE-BSA及不同預(yù)處理48h檢測ROS水平:與正常組比較,AGE-BSA組細胞內(nèi)ROS明顯增多(尸<0.01),是正常組的6.95倍,而NC組與BSA對照組比較無顯著差異,RAGE-Ab組、ALA組、DPI組細胞內(nèi)ROS水平較AGE-BSA組分別下降56.2%、46.5%、54.3%,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01),提示AGEs可能通過與其受體RAGE結(jié)合進而激活NADPH氧化

15、酶促進ROS的產(chǎn)生。
   4.免疫細胞熒光化學(xué)及免疫蛋白印跡方法觀察SH-SY5Y細胞中的GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表達并進行半定量分析
   4.1免疫細胞熒光化學(xué)方法觀察GRP78、p-eIF2α、Caspase-12在SH-SY5Y細胞的表達,AGE-BSA處理后熒光染色陽性細胞數(shù)明顯增多,GRP78主要在胞漿表達,而p-eIF2α全細胞都有表達,但胞核熒光強度更高,免疫蛋白印跡方法結(jié)果

16、顯示AGE-BSA分別處理細胞0、12、24、48h,GRP78、p-eIF2α、Caspase-12蛋白表達水平呈時間依賴性增高,GRP78、p-eIF2α在AGEs處理24h后出現(xiàn)表達峰值,Caspase-12在48h出現(xiàn)表達高峰。
   4.2按分組要求給予細胞不同處理24h,免疫蛋白印跡結(jié)果提示AGEs組GRP78、p-eIF2α蛋白表達水平分別為正常對照組的3.56倍、6.39倍,而預(yù)先用抗RAGE-Ab、DPI、AL

17、A分別處理細胞可以顯著降低GRP78、p-eIF2α的表達,GRP78下降率分別為39.5%、14.1%、19.3%,p-eIF2α下降率分別為28%、41%、33%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。處理48h后檢測Caspase-12蛋白表達水平,Caspase-12在正常細胞和BSA組弱表達,AGE-BSA作用于細胞可上調(diào)Caspase-12蛋白表達,與正常組和BSA組比較差異均有顯著性(P<0.01),麗應(yīng)用抗RA

18、GE-Ab、ALA和DPI分別預(yù)處理細胞均可部分阻斷AGE-BSA導(dǎo)致的Caspase-12上調(diào),下降率分別為35.9%、43.7%、50.5%,差異顯著(P<0.01)。
   結(jié)論
   1.AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合,進而激活SH-SY5Y的NADPH氧化酶促進促進ROS產(chǎn)生。
   2.AGEs可能通過促進ROS的產(chǎn)生引發(fā)GRP78表達增加及PERK-eIF2α途徑的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,進而誘導(dǎo)神經(jīng)細胞凋亡

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