內(nèi)質(zhì)網(wǎng)氧化應(yīng)激在自然流產(chǎn)中的作用.pdf

1、背景： 自然流產(chǎn)(spontaneous abortion)是指妊娠不足20周，胎兒體重不足500g而終止者。前期我們利用蛋白質(zhì)組學(xué)方法檢測自然流產(chǎn)患者蛻膜組織中蛋白質(zhì)的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)一些抗氧化物酶，參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ER stress)的葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白 78 (glucose regulated protein，GRP78)、含纈酪肽(valosin-containing p

2、rotein，VCP)以及泛素-蛋白酶體通路(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)的兩個成員表達(dá)均發(fā)生顯著性變化(數(shù)據(jù)尚未發(fā)表)，提示自然流產(chǎn)的發(fā)病可能有尚不為人知的機(jī)制參與。是否母胎界面的氧化應(yīng)激、ER．stress和UPP三者之間存在某種聯(lián)系，從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生，至今尚未有相關(guān)報道。 眾所周知，氧化應(yīng)激是指活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成和抗氧化防御系統(tǒng)之

3、間的不平衡狀態(tài)。這種不平衡狀態(tài)可在ROS的生成超過抗氧化防御系統(tǒng)或抗氧化劑活性降低或減少時發(fā)生。過量的：ROS可使磷脂中的不飽和脂肪酸生成過氧化脂質(zhì)，損傷生物膜：可以抑制蛋白質(zhì)功能；破壞核酸及染色體，從而傷害機(jī)體的各種組織和細(xì)胞。 研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激等可通過引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取/釋放Ca2+障礙或蛋白質(zhì)加工/運輸障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積累大量的未折疊/錯誤折疊蛋白質(zhì)而誘發(fā)ER stress，又稱未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded prot

4、ein response，UPR)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)折疊和裝配的場所，對細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)平衡非常敏感。ER stress引起包括編碼內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白在內(nèi)的一系列基因(如GRP78)表達(dá)增加，通過抑制蛋白質(zhì)翻譯，促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊，減少蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔堆積，從而對細(xì)胞起保護(hù)作用。GRP78是ER stress的典型分子標(biāo)記。那些最終不能達(dá)到正確折疊狀態(tài)的蛋白質(zhì)被逆轉(zhuǎn)回胞質(zhì)中，通過蛋白酶體降解。這種異常蛋白質(zhì)在胞質(zhì)中的降解，稱為內(nèi)質(zhì)

5、網(wǎng)相關(guān)性蛋白降解(endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD)。該降解機(jī)制由LJPP所介導(dǎo)。在這些蛋白質(zhì)的逆轉(zhuǎn)過程中，VCP發(fā)揮了重要作用。VCP是反常折疊蛋白的識別因子和病理效應(yīng)器，是ERAD所需的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)分子伴侶，陪伴底物從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆轉(zhuǎn)到細(xì)胞質(zhì)中，通過LJPP降解。VCP也是UPP降解過程中多泛素(Ubiquitin，Ub)鏈上的標(biāo)記因子，在此途徑中作為一個普遍存在的分子伴侶來標(biāo)

6、記多種底物，到蛋白酶處降解。VCP的缺失會導(dǎo)致UPP途徑的抑制和泛素化蛋白的蓄積。 UPP是ATP依賴的蛋白質(zhì)選擇性降解的主要途徑，是真核細(xì)胞內(nèi)重要的蛋白質(zhì)質(zhì)控系統(tǒng)，能夠高選擇性地降解細(xì)胞在應(yīng)激和非應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，其底物包括氧化損傷、突變的、異常的或短命的蛋白質(zhì)、錯誤折疊或錯誤定位的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)錄因子等許多調(diào)控蛋白質(zhì)，對維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有十分重要的意義。 另外，母體內(nèi)的孕激素水平及孕激素受體(progesterone re

7、ceptor，PR)在著床部位組織細(xì)胞中的表達(dá)，對受孕及維持妊娠的微環(huán)境具有極其重要的作用。孕激素是維持早期妊娠唯一必需的甾體激素，在女性生殖活動中起重要作用，該生理作用主要是通過與PR結(jié)合來調(diào)節(jié)的。PR與孕激素結(jié)合后會受到胞內(nèi)泛素蛋白的降解，UPP是其降解的主要通路。自然流產(chǎn)母胎界面PR蛋白表達(dá)是否異常，國內(nèi)外文獻(xiàn)報道不一。多數(shù)學(xué)者觀察到正常早孕婦女蛻膜組織中PR表達(dá)高于流產(chǎn)患者，認(rèn)為低PR表達(dá)是不明原因早期流產(chǎn)的病因，但也有文獻(xiàn)報道

8、兩者著床部位PR檢出率無統(tǒng)計學(xué)差異，對此本實驗也進(jìn)行了相關(guān)研究。 本研究采用免疫組織化學(xué)二步法對Ub、GRP78、VCP和PR在正常早期妊娠和自然流產(chǎn)患者蛻膜組織的表達(dá)進(jìn)行組織學(xué)定位；采用western blot方法檢測上述四個指標(biāo)在兩組蛻膜組織中的表達(dá)差異，推測它們之間的相關(guān)性以及與自然流產(chǎn)的關(guān)系；利用過氧化氫(hydrogen dioxide，H2O2)建立正常早期妊娠蛻膜細(xì)胞的氧化模型，模擬母胎界面的高氧環(huán)境，并用MG13

9、2(UPP特異性抑制劑)阻斷UPP途徑，采用MTT方法檢測細(xì)胞活性，免疫細(xì)胞化學(xué)和western blot方法檢測Ub、GRP78、VCP、PR在處理后蛻膜細(xì)胞中的表達(dá)，檢測氧化應(yīng)激是否通過引起ER stress和UPP途徑功能異常造成細(xì)胞損傷，導(dǎo)致自然流產(chǎn)的發(fā)生，從而為自然流產(chǎn)的病因做出新的解釋。 材料與方法： 1.選取臨床和B超診斷為難免流產(chǎn)的婦女，于門診手術(shù)室行吸宮術(shù)時，取其蛻膜組織作為病例組(n=20)；隨機(jī)選取

10、門診正常早孕要求人工流產(chǎn)的婦女，取其蛻膜組織作為正常組(n=20)。分別采用western blot方法進(jìn)行Ub、GRP78、VCP和PR蛋白檢測，對western blot結(jié)果進(jìn)行半定量分析。另隨機(jī)選取病例組和正常組各4例，采用免疫組織化學(xué)二步法對上述四個目的蛋白進(jìn)行組織學(xué)定位。 2.隨機(jī)選取門診正常早孕要求人工流產(chǎn)的婦女6例，在離體子宮蛻膜細(xì)胞培養(yǎng)基礎(chǔ)上，MTT法測定不同濃度的H2O2和MG132作用12h后蛻膜細(xì)胞的活性，

11、利用測得的OD值繪制細(xì)胞存活曲線。同時采用western blot方法檢測其Ub、GRP78、VCP和PR蛋白的表達(dá)；免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行上述四個目的蛋白的定位研究，并用人胎盤催乳素(human placental lactogen，HPL，)鑒定蛻膜細(xì)胞。 計量資料用平均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示，采用兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗，Mann-Whitney U檢驗進(jìn)行兩組間數(shù)據(jù)比較分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，雙側(cè)。所有實驗數(shù)據(jù)用SP

12、SS150統(tǒng)計軟件包進(jìn)行處理。 結(jié)果： 1.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在蛻膜組織的相對表達(dá)量Ub在病例組蛻膜組織的相對表達(dá)量為5.93+2.59，正常組中為4.04±1.64，樣本非正態(tài)分布，方差不齊，采用兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗，Mann-Whitney U檢驗，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，病例組的表達(dá)明顯高于正常組；GRP78、VCP和PR在病例組蛻膜組織的相對表達(dá)量分別為0.77+0.5、0.67~0.

13、21、0.664-0.3，正常組中分別為1.1±0.57、1.32±0.91、1.124-0.76，樣本非正態(tài)分布，方差不齊，采用兩個獨立樣本非參數(shù)檢驗，Mann．．‘Whitney U檢驗，P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，病例組的表達(dá)明顯低于正常組。 2.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在蛻膜組織的定位Ub主要表達(dá)于蛻膜組織上皮細(xì)胞的胞漿和胞核，間質(zhì)中有少量表達(dá)：GRP78和VCP表達(dá)于蛻膜組織腺上皮和間質(zhì)細(xì)胞的胞漿；PR

14、僅表達(dá)于間質(zhì)細(xì)胞的胞核。光學(xué)顯微鏡下觀察，與正常組比較，病例組中Ub表達(dá)增加，而VCP、GRP78和PR表達(dá)減少。 3.不同處理因素對蛻膜細(xì)胞的影響本研究采用不同濃度的H202、MG132與蛻膜細(xì)胞共培養(yǎng)12h后，對其活性進(jìn)行分析。隨H2O2濃度增大細(xì)胞活性逐漸下降，2000μm/L以上濃度的H2O2細(xì)胞活性幾乎無差別，均極低。測得對照組OD值為0.265～0.009：2.51μm/5μm/LMGl32 OD值分別為0.258±

15、0.014，0.238±0.019：2000/4000/8000μm/LH202OD值分別為0.018±0.004，0.02±0.006，0.02±0.002；2.5μm/LMG132＋2000/4000/8000μm/LLH2O2 OD值分別為0.018±0.003，0.019±0.004，0.027±0.005。 4.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在處理后蛻膜細(xì)胞的定位與免疫組織化學(xué)結(jié)果相類似，Ub定位于蛻膜細(xì)胞漿和胞核

16、，GRP78和VCP定位于胞漿，PR定位于胞核。光學(xué)顯微鏡下觀察，與未經(jīng)H2O2處理的蛻膜細(xì)胞相比，H2O2處理后Ub、GRP78表達(dá)增高，VCP表達(dá)降低而PR表達(dá)無明顯變化。HPL免疫染色示95％以上的蛻膜細(xì)胞均陽性。 5.Ub、GRP78、VCP和PR蛋白在處理后蛻膜細(xì)胞的相對表達(dá)量與對照組比較，2.5μm/5μm/LMG132處理的細(xì)胞，Ub和GRP78的表達(dá)逐漸增加，VCP、PR無明顯變化；2000μm/L、4000μm

17、/L和8000μm/LH2O2處理后，Ub和GRP78的表達(dá)逐漸增加，VCP在8000μm/LH2O2處理組表達(dá)減少，PR均無明顯變化；2.5μm/LMG132+2000/4000/8000/LH202處理后，Ub、VCP、GRP78和PR均無明顯變化。 結(jié)論： 1.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激參與自然流產(chǎn)的病理生理機(jī)制。 2.母胎界面的氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生，從而促進(jìn)自然流產(chǎn)的發(fā)生。 3.氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起