內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與氧化應(yīng)激在膜性腎病中的作用及機(jī)制.pdf

1、目的:研究膜性腎病(membranous nephropathy，MN)發(fā)病過(guò)程中足細(xì)胞損傷機(jī)制，初步探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)和氧化應(yīng)激在MN發(fā)病過(guò)程中的作用。
　　方法:SD雄性大鼠85只，隨機(jī)分為5組:正常組(不預(yù)免，不免疫，其他實(shí)驗(yàn)組正式實(shí)驗(yàn)時(shí)予以隔日尾靜脈注射1ml生理鹽水(NS)，同時(shí)NS1ml/d灌胃，n=20）;模型組(按照改良的Border法予以C-BSA復(fù)

2、制MN大鼠模型，同時(shí)NS1ml/d灌胃，n=20);NAC1干預(yù)組(復(fù)制C-BSA MN大鼠模型，同時(shí)灌胃N-乙酰半胱氨酸(NAC)100mg/kg/d，n=20);NAC2干預(yù)組(復(fù)制C-BSA MN大鼠模型，同時(shí)灌胃NAC200mg/kg/d，n=20); NAC藥物對(duì)照組（不預(yù)免，不免疫，其他實(shí)驗(yàn)組正式實(shí)驗(yàn)時(shí)予以隔日尾靜脈注射1ml NS，同時(shí)灌胃NAC200mg/kg/d，n=5）。藥物對(duì)照組在正式免疫后第1、2、3、4周末檢測(cè)

3、24hUTP，第4周殺檢;其余組在正式免疫后第1、2、3、4周分別隨機(jī)取5只大鼠殺檢，并于處死前檢測(cè)24hUTP;在各組殺檢時(shí)心臟取血檢查ALB、TG、TC等生化指標(biāo);采用分光光度法檢測(cè)血清中的SOD、MDA;取大鼠腎臟分別進(jìn)行光鏡、電鏡、免疫熒光鑒定成模情況及病理變化;用TUNEL法檢測(cè)各組腎小球固有細(xì)胞凋亡情況并計(jì)算凋亡指數(shù)(AI);免疫組化法檢測(cè)各組腎小球中GRP78、TRAF2、Caspase12、WT-1蛋白不同時(shí)間點(diǎn)的半定量

4、，并根據(jù)WT-1免疫組化結(jié)果計(jì)算足細(xì)胞密度;相關(guān)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)行Pearson相關(guān)分析。
　　結(jié)果:(1)生化指標(biāo)變化正常組各實(shí)驗(yàn)指標(biāo)均正常;與正常組比較，模型組24hUTP、TG、TC呈時(shí)間依賴性升高，ALB隨實(shí)驗(yàn)進(jìn)展逐漸降低，24hUTP、ALB在第2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，TG、TC在第3、4周均有明顯差異(P＜0.05);經(jīng)過(guò)NAC治療后，NAC1組、NAC2組24hUTP、TG、TC水平下降，ALB水平上升，

5、第3、4周24hUTP較模型組均有顯著性差異（P＜0.05），第4周ALB較模型組均有顯著差異（P＜0.05），NAC2組TG于第4周接近正常，較模型組有明顯差異(P＜0.05);藥物對(duì)照組臨床實(shí)驗(yàn)指標(biāo)較正常組無(wú)明顯異常。(2)腎臟形態(tài)學(xué)改變正常組與藥物對(duì)照組腎臟顏色正常，未見明顯形態(tài)學(xué)變化，無(wú)見電子致密物沉積，無(wú)免疫熒光沉積。與正常組比較，模型組隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)展，腎臟體積逐漸增大，色澤蒼白，病理?yè)p害逐漸加重，腎小球毛細(xì)血管袢熒光強(qiáng)度逐漸增

6、強(qiáng);第4周時(shí)，模型組腎臟體積明顯增大，邊緣圓鈍，呈“大白腎”樣外觀，光鏡下見腎小球明顯腫脹，少部分球囊腔狹窄，基底膜(GBM)彌漫性增厚，足細(xì)胞側(cè)“釘突”形成，部分釘突頂部融合，呈“假雙軌”結(jié)構(gòu)，腎間質(zhì)可見少許膠原纖維沉積，間質(zhì)明顯增寬，電鏡下可見上皮下大量電子致密物沉積，毛細(xì)血管袢免疫熒光強(qiáng)度+++-+++++。與模型組比較， NAC1組、NAC2組病理?yè)p傷明顯減輕，部分GBM增厚，呈“綢緞”樣空泡變性，少量“釘突”形成，少許免疫復(fù)合

7、物在上皮下沉積，未見明顯“假雙軌”改變，兩組間免疫熒光強(qiáng)度較模型組稍減弱，但無(wú)顯著性差異。(3)腎小球固有細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化正常組與藥物對(duì)照組罕見細(xì)胞凋亡;模型組腎小球細(xì)胞凋亡較正常組明顯增多，第1、2、3、4周較正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);與模型組比較，NAC1組、NAC2組腎小球細(xì)胞凋亡減少，第4周較模型組均有明顯差異（P＜0.05），但仍均高于正常組(P＜0.05)。(4)足細(xì)胞密度變化正常組各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯差異;與正常

8、組比較，模型組第1周足細(xì)胞密度開始減少，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第2、3、4周明顯下降(P＜0.05);經(jīng)干預(yù)治療后，NAC1組、NAC2組足細(xì)胞密度較模型組略增大，于第4周出現(xiàn)明顯差異(P＜0.05)，足細(xì)胞密度增大與NAC劑量有一定關(guān)系，但整個(gè)治療過(guò)程中同期比較均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與正常組比較，藥物對(duì)照組第4周足細(xì)胞密度無(wú)明顯差異。(5)血清中SOD、MDA變化與正常組比較，模型組大鼠血清中SOD表達(dá)量呈應(yīng)激性升高，隨后呈時(shí)間依賴性下降，第1、

9、2、3、4周均有顯著性差異(P＜0.05);模型組MDA呈升高趨勢(shì)，第1、2、3、4周較正常組均有顯著性差異(P＜0.05);經(jīng)NAC干預(yù)后，NAC1組、NAC2組大鼠血清中SOD升高、MDA降低，在第3、4周較模型組均有明顯差異(P＜0.05)，第4周NAC2組MDA接近正常組。(6)腎臟組織免疫組化結(jié)果正常組大鼠GRP78主要集中在腎小管細(xì)胞胞漿表達(dá)，腎小球內(nèi)表達(dá)較少;與正常組比較，模型組GRP78表達(dá)位置相同，腎小球GRP78表達(dá)

10、在實(shí)驗(yàn)前3周呈時(shí)間依賴性升高，隨后呈下降趨勢(shì)，第1、2、3、4周較正常組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）;與模型組比較，NAC1、NAC2組腎小球GRP78表達(dá)減弱，第2周有明顯差異(P＜0.05);與正常組比較，NAC1、NAC2組第1、2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。正常組大鼠TRAF2表達(dá)量較少，主要集中在腎小球表達(dá)，近遠(yuǎn)端小管少量表達(dá)，集合管幾乎不表達(dá);與正常組比較，模型組腎小球TRAF2呈時(shí)間依賴性升高，第1、2、3

11、、4周均有顯著性差異(P＜0.05);Caspase12在正常組大鼠少量表達(dá)，主要定位在集合管和近遠(yuǎn)端小管細(xì)胞胞漿，腎小球少量表達(dá);與正常組比較，模型組腎小球Caspase12呈時(shí)間依賴性升高，第2、3、4周均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)NAC抗氧化處理后，NAC1、NAC2組腎小球TRAF2、Caspase12表達(dá)均減弱，在第3、4周較模型組均有顯著差異(P＜0.05)，但仍較正常組升高(P＜0.05)。第4周藥物對(duì)照組的GRP7

12、8、TRAF2、Caspase12表達(dá)位置同正常組，其在腎小球表達(dá)較正常組均無(wú)明顯差異。(7)模型組各指標(biāo)相關(guān)性分析24hUTP與腎小球AI呈正相關(guān)，與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān);SOD與24hUTP、腎小球AI呈負(fù)相關(guān)，與足細(xì)胞密度呈正相關(guān);MDA與24hUTP、腎小球AI呈正相關(guān)，與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān);腎小球Caspase12與足細(xì)胞密度呈顯著負(fù)相關(guān)，與腎小球AI呈正相關(guān);腎小球AI與足細(xì)胞密度呈負(fù)相關(guān)。
　　結(jié)論:(1)氧化應(yīng)激與內(nèi)