內質網應激在非酒精性脂肪性肝病肝細胞損傷中的作用及機制研究.pdf

1、第一部分非酒精性脂肪肝患者肝功能損害與體內脂質過氧化水平的關系。 背景：非酒精性脂肪性肝病是一組與肥胖、胰島素抵抗有關的疾病，氧化應激是其病情進展的關鍵因素。為進一步探討肥胖，高血糖，高脂蛋白血癥，氧應激這些因素對NAFLD患者肝細胞損傷的影響，我們擬對比分析健康者與NAFLD患者血清轉氨酶的變化與MDA、GSH、GSSG以及糖脂代謝相關指標的關系，探討脂質過氧化反應在NAFLD患者病情發(fā)展中的意義，以期對非酒精性脂肪性肝病的臨

2、床防治和機制探討提供依據。 方法：依據中華醫(yī)學會肝病學分會脂肪肝和酒精性肝病學組制定的非酒精性脂肪性肝病診療指南診斷為非酒精性脂肪性肝病的患者89例，另選正常健康體檢者30例為對照組。體檢當天清晨空腹分別收集血清做ALT、AST、GGT水平檢測以及測定血糖、血脂、身高、體重、腰圍、臀圍等指標參數，詳細詢問病史完成調查問卷，同時抽空腹血做GSH、GSSG及MDA水平檢測，分析兩組之間各指標的差異并對各指標與ALT、AST、GGT進

3、行線性多元回歸分析。 結果：除年齡以及身高外，NAFLD患者與對照組的收縮壓、舒張壓、體重、BMI、腰圍、臀圍及腰臀比分別為：131.0899±16.06mmHg vs111.7667±9.6622mmHg，80.7865±10.7508mmHg vs72.1333±5.5939mmHg，27.4738±2.7044Kg/㎡vs22.348±1.4957Kg/㎡，73.6067±10.1148Kg vs60.6667±6.121

4、4 Kg，0.9888±0.0675m vs0.7497±0.0494m，1.3933±0.0606m vs0.88±0.0585m，0.985±0.0364 vs0.853±0.0197，各指標NAFLD患者均顯著高于對照組（P<0.05）。代謝指標的分析中，NAFLD患者平均空腹血糖水平為6.9204±2.3619mol/L，甘油三酯為2.1498±1.1454mmol/L，總膽固醇為4.9415±0.9635 mmol/L，低密度

5、脂蛋白為2.7342±0.7426 mmol/L，脂肪酸為0.6481±0.1497mmol/L均顯著高于對照組（分別為：4.703±0.5628mmol/L，1.1369±0.1712mmol/L，4.2047±0.3735mmol/L，2.1693±0.2936mmol/L，0.5193±0.1095mmol/L。P<0.05），高密度脂蛋白為1.0488±0.1953 mmol/L，顯著低于對照組1.374±0.0878mmol/

6、L（P<0.05）。肝功能分析結果顯示NAFLD患者血清ALT、AST、GGT分別為55.8202±31.4638u/L，40.3258±25.947u/L及60.3933±50.9723u/L均明顯高于對照組（分別為21.7667±6.447u/L，17.7333±3.805u/L，20.3±6.984，P<0.05）。氧化應激指標結果顯示，NAFLD患者血清中GSSG及MDA含量分別為44.5996±8.4965μmol/L及3.4

7、401±0.6452μmol/L，比對照組26.4127±2.04μmol/L及2.2683±0.1016μmol/L明顯升高（P<0.05），而 GSH為254.2137±35.9436μmol/L比正常對照320.3693±36.5549μmol/L顯著降低（P<0.05）。多元線性回歸分析結果表明，在BMI、腰臀比、高血壓、高血糖、高血脂及氧化應激水平等因素中，MDA、GSSG、GSH及GSH/GSSG對NAFLD患者血清轉氨酶A

8、LT、AST影響最明顯，其中，GSH及GSH/GSSG與ALT、AST成負相關（P<0.05）。對GGT影響最大的因素分別是GSSG和MDA（P<0.05），GSH及GSH/GSSG對GGT的影響沒有顯著性（P>0.05）。 結論：NAFLD是一組與肥胖和血糖、血脂代謝紊亂有關的疾病，在NAFLD患者體內存在氧化/抗氧化穩(wěn)態(tài)的失衡，并與肝細胞損傷密切相關。多元線性回歸分析結果表明肥胖及血糖血脂異常雖然與NAFLD發(fā)病有關，但是脂

9、質過氧化的水平才是對患者肝功能影響最大的因素。血清MDA、GSSG及GSH/GSSG水平的異?？赡苁欠从砃AFLD患者肝細胞受損的敏感的血清學指標。第二部分軟脂酸鈉體外誘導肝細胞內質網應激及細胞凋亡信號通路的體外實驗。 背景：內質網應激由缺氧、營養(yǎng)缺乏、氧化應激、錯誤合成或未折疊的蛋白質增多等因素誘發(fā)，內質網應激發(fā)生后通過啟動有關細胞信號轉導途徑抑制細胞蛋白合成，水解錯誤合成的蛋白，并對不能修復的細胞則通過內質網相關細胞凋亡機

10、制誘導其凋亡以維持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)。研究證實過強和過長的內質網應激反應通過細胞能量耗竭、鈣穩(wěn)態(tài)失衡、激活內質網應激相關細胞凋亡等機制使器官和組織產生損傷，其中內質網應激相關細胞凋亡是應激狀態(tài)下細胞損傷的主要機制。脂質過氧化是內質網應激的誘導因素，軟脂酸鈉可能通過誘導內質網應激造成肝細胞損傷、產生細胞凋亡。本部分研究擬通過軟脂酸鈉與人L02肝細胞體外共培養(yǎng)，誘導其產生脂肪變性建立非酒精性脂肪性肝病的細胞模型，分析飽和脂肪酸（軟脂酸鈉）體外對內質

11、網應激的誘導情況和對肝細胞凋亡和損傷的影響，并探討軟脂酸鈉誘導肝細胞內質網應激后細胞凋亡可能的信號途徑。 方法：以人正常肝細胞L02細胞系為實驗對象，不加任何處理因素為正常對照組，用軟脂酸鈉處理L02細胞誘導其產生脂肪變性作為模型組，軟脂酸鈉及還原性谷胱甘肽聯合處理為干預組。MTT法檢測細胞活性，篩選軟脂酸鈉最佳作用濃度及時間，AnnexinⅤ/PI流式細胞儀定量檢測細胞凋亡水平。同時檢測細胞及細胞上清液GSSG以及MDA含量，

12、評價脂質過氧化水平。RT-PCR分析軟脂酸鈉處理后L02細胞ATF4 mRNA變化趨勢，western-blotting分析p-PERK、ATF4以及CHOP蛋白水平的變化，同時檢測Caspase-4活性。并用還原性谷胱甘肽為還原劑觀察干預脂質過氧化反應后上述模型相關指標的變化。 結果：1、用軟脂酸鈉成功誘導建立L02肝細胞株脂肪變性模型。光鏡下油紅“o”染色顯示，肝細胞可見大量橘紅色脂滴，并隨軟脂酸鈉濃度增加和時間延長而更加明

13、顯。2、與正常對照組比較，模型組培養(yǎng)上清的轉氨酶（ALT、AST）水平及脂質過氧化（GSSG、MDA）水平明顯升高，干預組的相應指標呈顯著下降趨勢（P<0.05）。3、MTT及凋亡率檢測結果發(fā)現，L02細胞暴露在不同濃度軟脂酸鈉中的時間越長，劑量越大，細胞凋亡越多，與正常對照組比較差異具有統計學意義（P<0.05）。給予GSH干預后，可以觀察到明顯的細胞保護效應，L02細胞凋亡率明顯下降（P<0.05）。4、內質網應激信號及通路研究，在

14、模型組，L02細胞GRP78蛋白水平明顯增加，p-PERK水平在軟脂酸鈉處理12小時后開始升高，24小時達到高峰，ATF4 mRNA表達在軟脂酸鈉作用后2小時開始上調，12小時達到高峰，20小時以后開始下降，ATF4蛋白水平在24小時有所增加，與正常對照比較差異有統計學意義（P<0.05）。雖然CHOP蛋白水平也有上升趨勢，但是與正常對照組相比沒有統計學意義（P>0.05）。GSH干預后，GRP78蛋白、p-PERK水平、ATF4 mR

15、NA及蛋白水平均明顯下降（P<0.05），CHOP蛋白水平也有下降趨勢，但是差異沒有顯著性（P>0.05）。在模型組，Caspase-4活性明顯升高，加入GSH后則明顯被抑制（P<0.05）。 結論：軟脂酸鈉誘導的脂肪變肝細胞內質網應激是介導非酒精性肝病肝細胞損傷的重要事件。軟脂酸鈉通過上調GRP78表達，啟動內質網應激導致肝細胞凋亡。外源性補充抗氧化劑可以降低脂質過氧化反應，減輕內質網應激程度，減弱軟脂酸鈉對肝細胞的毒性。內質