Caveolin-1在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制中的作用研究.pdf

1、研究背景:
　　非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外酒精和其他明確肝損因素所致的以肝細(xì)胞脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[1]。隨著生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改變，NAFLD患病率近年來逐年增高，我國已達(dá)到15％左右，西方發(fā)達(dá)國家更是高達(dá)20％-30％，成為最常見的慢性肝病之一，構(gòu)成日益嚴(yán)重的社會(huì)健康問題[2，3]。NAFLD包括一系列相互聯(lián)系的病理改變，從單

2、純性脂肪肝到脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)、肝纖維化和肝硬化[4]?？偟膩碚f，單純性NAFLD是一種良性疾病，而NASH卻可以逐漸向肝硬化、肝癌等終末期肝病進(jìn)展[4、5]。
　　NAFLD發(fā)生發(fā)展機(jī)制目前尚未完全明確，其治療也缺乏特別有效方法?！岸未驌簟睂W(xué)說[6]認(rèn)為，胰島素抵抗引起的外周脂肪分解增加和高胰島素血癥，是導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性的首要因素;國外針對(duì)這一機(jī)制設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)結(jié)

3、果提示改善胰島素抵抗并非對(duì)所有NAFLD患者均有效，其主要原因是“二次打擊”學(xué)說并不能完全解釋NAFLD的全部機(jī)制，提示還存在其他機(jī)制參與NAFLD的發(fā)生發(fā)展。NAFLD的發(fā)生是肝細(xì)胞不斷貯積脂質(zhì)的過程，從肝細(xì)胞脂質(zhì)貯積的分子機(jī)制切入或許可為認(rèn)識(shí)NAFLD發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供新的線索。微囊蛋白1（Caveolin-1）是分子量為21-24kD的多功能信號(hào)蛋白，為小凹家族中最重要的成員，富集于細(xì)胞膜特異結(jié)構(gòu)小凹、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體等，并可在胞漿

4、和胞膜之間穿梭。Caveolin-1的氨基酸序列中包括一段長達(dá)33個(gè)氨基酸(102-134氨基酸殘基)的疏水區(qū)域，該疏水區(qū)域兩端均帶有一個(gè)脯氨酸殘基，借助這兩個(gè)脯氨酸殘基形成一個(gè)N末端、 C末端均面向胞漿的發(fā)夾結(jié)構(gòu)。其中N末端(82-101氨基酸殘基)是人類Caveolin-1蛋白序列中高度保守的骨架區(qū)域。已有研究顯示，Caveolin-1在保持質(zhì)膜微囊的完整性、小胞運(yùn)輸、信號(hào)的傳導(dǎo)中均起重要作用[7]。
　　近年來，Caveol

5、in-1在脂質(zhì)代謝中的作用受到越來越多的關(guān)注。Frank等觀察到Caveolin-1表達(dá)缺失小鼠高脂飲食喂養(yǎng)后不出現(xiàn)肥胖，提示Caveolin-1是高脂飲食誘發(fā)肥胖的關(guān)鍵基因之一[8]。后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1表達(dá)缺失可預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化、2型糖尿病等糖脂代謝紊亂疾病的發(fā)生，提示Caveolin-1在這些代謝性疾病中的重要作用[9，10]。
　　為此，本研究利用高脂飲食建立NAFLD小鼠模型、FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞脂肪變

6、性，應(yīng)用RT-PCR及Western blot方法，檢測(cè)微囊蛋白-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平，及其對(duì)脂質(zhì)合成相關(guān)的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白（SREBP-1）、脂肪酸合成酶(FASN)、乙酰輔酶A羧化酶(ACC)、環(huán)氧合酶2(COX-2)等的作用，探索Caveolin-1在NAFLD發(fā)病中的作用及可能機(jī)制。
　　目的:
　　本研究旨在通過觀察NAFLD小鼠肝組織Caveolin-1的mRNA和蛋白的表達(dá)情況及FFA誘導(dǎo)脂肪變性的L

7、02細(xì)胞中，通過抑制或高表達(dá)Caveolin-1觀察SREBP-1、FASN、ACC、COX-2的變化及TG濃度變化，探究其對(duì)脂質(zhì)合成的作用。
　　方法:
　　1在體小鼠模型建立:高脂飲食喂養(yǎng)C57小鼠建立NAFLD動(dòng)物模型，具體方法為:雄性SPF級(jí)C57小鼠根據(jù)體重分層，隨機(jī)化分組，對(duì)照組喂養(yǎng)普通飼料，實(shí)驗(yàn)組喂養(yǎng)高脂飼料（80.5％普通飼料、2％膽固醇、7％豬油、10％蛋黃粉和0.5％膽鹽）。造模第4周，第8周、12周末處

8、死小鼠。
　　2細(xì)胞模型建立:采用軟脂酸誘導(dǎo)正常人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞建立NAFLD體外模型，具體方案為:正常人肝細(xì)胞株L02細(xì)胞用含胎牛血清、青鏈霉素的MEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，直至細(xì)胞達(dá)到80-100％融合度。軟脂酸和油酸混合物終濃度1mM（軟脂酸∶油酸=1∶2），添加胎牛血清白蛋白1％加入DMEM培養(yǎng)基中。培養(yǎng)48h后收獲。油紅O染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況，收集細(xì)胞凍溶液測(cè)定其中TG的含量，綜合評(píng)估建模情況。
　　3從小鼠肝

9、臟組織中、FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中提取RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，根據(jù)合成的Caveolin-1引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR(SYBR法)，對(duì)Caveolin-1的mRNA在兩組小鼠中及FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中的變化進(jìn)行相對(duì)定量分析。
　　4從小鼠肝臟組織、FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中提取總蛋白，行Western Blot。觀察實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組小鼠肝臟及FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞中Caveolin-1在蛋白水平的變化，進(jìn)一步證實(shí)其變化是否與mRNA水平變

10、化相對(duì)應(yīng)。
　　5運(yùn)用siRNA和重組腺病毒載體的方法，抑制或增強(qiáng)NAFLD細(xì)胞模型Caveolin-1的表達(dá)，檢測(cè)肝細(xì)胞的脂肪變性程度，并進(jìn)一步運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western Blot等方法，檢測(cè)Caveolin-1表達(dá)抑制或增強(qiáng)后， NAFLD細(xì)胞模型中SREBP-1、FASN、ACC、COX-2指標(biāo)的變化及可能機(jī)制。
　　結(jié)果:
　　1 NAFLD小鼠肝組織Caveolin-1 mRNA及蛋白表達(dá)比對(duì)照組

11、明顯下降。
　　2 FFA誘導(dǎo)L02細(xì)胞脂變過程中Caveolin-1 mRNA及蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組明顯下降。
　　3抑制Caveolin-1后L02細(xì)胞脂變加劇，與脂質(zhì)合成相關(guān)的蛋白SREBP-1、FASN、ACC、COX-2蛋白水平升高，高表達(dá)Caveolin-1后L02細(xì)胞脂變改善，與脂質(zhì)合成相關(guān)的蛋白SREBP-1、FASN、ACC、COX-2蛋白水平降低
　　結(jié)論:
　　Caveolin-1可能在NA