從肝細(xì)胞的成脂性改變探討非酒精性脂肪性肝病的發(fā)病機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾個方面展開論述:
　　第一部分 高脂飲食誘導(dǎo)小鼠NAFLD模型的建立和評估
　　目的：建立高脂飲食誘導(dǎo)C57BL/6J小鼠非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）模型，并明確其病理生理變化。
　　方法：選取雄性C57BL/6J小鼠60只，隨機(jī)分為正常飲食組和進(jìn)食高脂飼料組（42％脂肪供能），每組30只。持續(xù)喂養(yǎng)24周，分別于造模12周、16周、20周和24周各組隨機(jī)抽取5只動物處死。觀察體重、肝臟濕重和肝臟組織

2、學(xué)的變化。心臟取血檢測血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、白蛋白（Alb）、甘油三酯（TG）和空腹血糖（Glu）的變化。SABC免疫組化技術(shù)檢測小鼠肝組織中CD68的變化。運(yùn)用RT-PCR技術(shù)檢測肝組織中c-Jun氨基末端激酶1（JNK1）的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：從12周開始，HE染色顯示超過70％的高脂飼養(yǎng)小鼠的肝臟發(fā)生了脂肪變，到20周所有高脂飲食組小鼠的肝臟均發(fā)生了脂肪變，其肝臟脂肪變的程度未隨著喂養(yǎng)時間的延長而明顯加重。油紅O染色

3、顯示高脂飲食組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)大小不等的橘紅色脂滴。從12周開始高脂飲食組小鼠體重、肝臟濕重明顯高于正常飲食組小鼠(P<0.05)。高脂小鼠血清ALT、TG和Glu的水平逐漸升高，并從16周開始與正常飲食小鼠相比有顯著差異(P<0.05)。而高脂飲食組血清Alb水平逐漸降低。免疫組化染色顯示高脂飲食小鼠肝臟組織中CD68的表達(dá)較正常飲食組增加。RT-PCR顯示在喂養(yǎng)24周后高脂飲食小鼠肝組織中JNK1的表達(dá)量是正常飲食組的3~7倍。

4、r>　　結(jié)論：高脂飲食飼養(yǎng) C57BL/6J小鼠12~24周可成功構(gòu)建NAFLD模型，該模型的特征為肥胖、高脂血癥、胰島素抵抗和肝臟脂肪變。高脂飲食能激活肝組織JNK1的表達(dá)，誘導(dǎo)和加重肝臟的胰島素抵抗。
　　第二部分 NAFLD小鼠模型和患者肝臟中脂肪細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)
　　目的：研究非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)小鼠模型和患者肝穿標(biāo)本肝臟中脂肪細(xì)胞特異性蛋白的表達(dá)變化及意義。
　　方法：對高脂飲食造模的雄性C5

5、7BL/6J小鼠及正常飲食的同種小鼠分別在12周、16周、20周和24周運(yùn)用RT-PCR和Western blot技術(shù)檢測肝臟組織中脂肪細(xì)胞標(biāo)志物的變化：脂肪細(xì)胞脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)、過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)、CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白（C/EBPα）和脂聯(lián)素(adiponectin)。Western blot技術(shù)檢測肝臟組織中上皮細(xì)胞的標(biāo)志蛋白E-Cadherin的表達(dá)。對16例肝穿病理診斷脂肪肝患者和10例正常

6、肝組織石蠟包埋標(biāo)本行切片及SABC免疫組化染色檢測PPARγ的表達(dá)定位，并應(yīng)用免疫熒光雙重染色技術(shù)明確脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2在NAFLD患者肝組織中的表達(dá)定位。
　　結(jié)果：RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，高脂飲食組小鼠在喂養(yǎng)24周過程中肝臟aP2和PPARγ的表達(dá)較正常飲食組小鼠分別增加了2~3倍和4~9倍，Western blot也顯示了其同樣的變化。而高脂飲食組小鼠肝臟C/EBPα和adiponectin的mRNA表達(dá)較正常飲食組小鼠降低

7、，僅C/EBPα在喂養(yǎng)24周時表達(dá)較正常飲食組升高約1.4倍，Western blot檢測也顯示了高脂飲食組C/EBPα和adiponectin蛋白的表達(dá)均較正常飲食組降低。肝臟組織中E-Cadherin蛋白的表達(dá)在高脂飲食組隨著喂養(yǎng)時間的延長逐漸減低。免疫組化染色發(fā)現(xiàn)PPARγ在NAFLD患者肝臟中表達(dá)增加，并主要表達(dá)于細(xì)胞核內(nèi)。組織切片免疫熒光雙重染色結(jié)果顯示NAFLD患者肝臟中有aP2表達(dá)，并且aP2與白蛋白的表達(dá)位置重疊，均出現(xiàn)

8、在肝細(xì)胞胞漿內(nèi)，而白蛋白的表達(dá)明顯較對照組降低。
　　結(jié)論：在高脂飲食小鼠NAFLD模型和NAFLD患者肝臟中，發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)部分脂肪細(xì)胞特異性蛋白，即發(fā)生了成脂性改變，而其自身上皮細(xì)胞表型和分泌功能均降低。
　　第三部分 肝細(xì)胞的成脂性改變對kupffer細(xì)胞活化的影響
　　目的：研究原代分離的脂肪變肝細(xì)胞對kupffer細(xì)胞系RAW264.7活化的影響。
　　方法：在高脂飲食組和正常飲食組均喂養(yǎng)到20周時

9、，利用膠原酶灌流+低速等密度percoll離心法分離培養(yǎng)小鼠原代肝細(xì)胞。油紅O染色檢測肝細(xì)胞的脂肪變情況。免疫熒光染色檢測肝細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2和上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cadherin的變化。原代分離的肝細(xì)胞體外培養(yǎng)24小時后，在transwell小室中與6孔板內(nèi)的kupffer細(xì)胞系共培養(yǎng)。共培養(yǎng)48小時后，ELISA法檢測細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的變化。CFSE染色kupffer細(xì)胞及流式細(xì)

10、胞術(shù)檢測其增殖情況。Western blot檢測kupffer細(xì)胞CD68表達(dá)的變化。
　　結(jié)果：油紅O染色可顯示高脂飲食組小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)存在大量橘紅色脂滴。免疫熒光雙重染色可見高脂飲食組小鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)脂肪細(xì)胞標(biāo)志物aP2與白蛋白（Alb）共定位，并且其Alb和E-cadherin的表達(dá)均較正常飲食組降低。共培養(yǎng)48小時后，脂肪變肝細(xì)胞+kupffer細(xì)胞組的細(xì)胞上清液中炎癥因子TNF-α、MCP-1、IL-6、IL-18的表

11、達(dá)較其他對照組明顯升高（P<0.05），并且脂肪變肝細(xì)胞自身也能分泌炎癥因子。流式細(xì)胞術(shù)檢測 CFSE染色與脂肪變肝細(xì)胞共培養(yǎng)的kupffer細(xì)胞出現(xiàn)明顯增殖。Western blot檢測脂肪變肝細(xì)胞+kupffer細(xì)胞組共培養(yǎng)的kupffer細(xì)胞CD68蛋白的表達(dá)量較對照組明顯升高（P<0.05）。
　　結(jié)論：成脂性改變的肝細(xì)胞雖然其自身分泌功能和上皮細(xì)胞表型被削弱，但是能分泌細(xì)胞因子，并能在體外刺激 kupffer細(xì)胞的活化，