內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶PDI在非酒精性脂肪性肝病中的作用及機制研究.pdf

1、目的：近年來,隨著經(jīng)濟水平的提高,生活方式的改變,非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)已成為我國導致慢性肝病的重要原因之一,其中,非酒精性單純性脂肪肝是一種良性病變,而非酒精性脂肪性肝炎則會進展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病。目前,NAFLD的發(fā)病機制尚不明確,已有一些研究表明,肝細胞凋亡是促進其進展的重要病理生理改變,且程度與疾病嚴重程度呈正相關,但其中的機制仍未完

2、全闡明。研究證實,過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激易導致細胞功能障礙及細胞凋亡,而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的分子伴侶或許可以影響此過程。蛋白質(zhì)二硫鍵異構酶(protein disulfide isomerase,PDI)是一種定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔的分子伴侶,在NAFLD中PDI是否可影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激所誘導的細胞凋亡過程,目前尚未見文獻報道。本研究旨在通過體外實驗的方法,探索PDI在此過程中所起的作用,同時試圖闡明其可能的機制。
　　 方法：⑴細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:HL-7

3、702細胞用加入了10％胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng),并置于含5％CO2的37℃恒溫培養(yǎng)箱中。傳代至狀態(tài)良好時,消化后鋪至12孔板中,按LipofectamineTM2000說明書進行轉(zhuǎn)染操作。72h后改用1mM FFA高脂培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h。⑵油紅O染色:吸去培養(yǎng)基,用PBS輕柔漂洗后加入12％中性甲醛固定15min,然后用油紅稀釋液染色15min,60％異丙醇漂洗后用蘇木素復染5min,顯微鏡下觀察并拍照。⑶Western

4、 Blot檢測:收集12孔板中的細胞并提取蛋白,將各組蛋白加入相應泳道后進行SDS-PAGE電泳,然后將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上,封閉1 h,一抗4℃孵育過夜,再用二抗孵育后行ECL法檢測,最后用凝膠成像系統(tǒng)拍照。⑷細胞凋亡檢測:細胞用冷的PBS洗兩次并重懸后,加入適量的AnnexinⅤ和PI染色,混勻后避光孵育15min,孵育后加入1×buffer400ul,用流式細胞儀完成檢測。
　　 結(jié)果：①油紅O染色:與對照組相比,FFA脂

5、變誘導組細胞胞漿內(nèi)可見大量紅染的脂滴,但經(jīng)高脂培養(yǎng)基誘導的三組,即單純FFA誘導組、PDI-negativesiRNA+FFA誘導組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導組組間差異不明顯。②細胞凋亡結(jié)果:與對照組相比,單純FFA誘導組、PDI—negative siRNA+FFA誘導組、PDI-siRNA Mix+FFA誘導組的細胞凋亡比例依次升高。③內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激及凋亡相關指標:與對照組相比,GRP78在單純FFA誘導組、PDI—neg

6、ative siRNA+FFA誘導組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導組的表達均增高,并以PDI-siRNA Mix+FFA誘導組增高最明顯。而CHOP在對照組、單純FFA誘導組、PDI-negative siRNA+FFA誘導組及PDI-siRNA Mix+FFA誘導組的表達是依次增高的。另外,IRE1在各組表達情況無明顯差異。
　　 結(jié)論：⑴PDI表達下調(diào)能加重內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激程度；⑵PDI表達下調(diào)能加重由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導的細