AHR信號(hào)通路在白癜風(fēng)氧化應(yīng)激發(fā)病中的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、背景：白癜風(fēng)是黑素細(xì)胞被破壞所致的色素脫失性皮膚病，其發(fā)病機(jī)制尚未充分闡明。大量研究表明，氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中發(fā)揮關(guān)鍵作用，可直接導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡，亦可繼而誘發(fā)自身免疫反應(yīng)破壞黑素細(xì)胞，是白癜風(fēng)發(fā)病的始動(dòng)環(huán)節(jié)。多種因素共同作用可打破黑素細(xì)胞氧化-抗氧化平衡，致使活性氧簇（Reactive oxygen species, ROS）過(guò)量蓄積，介導(dǎo)DNA、蛋白、脂類(lèi)及線粒體等發(fā)生過(guò)氧化反應(yīng)。其中，嚴(yán)重的線粒體氧化損傷可直接激活凋亡途徑，誘發(fā)

2、黑素細(xì)胞凋亡，在白癜風(fēng)氧化應(yīng)激發(fā)病中發(fā)揮重要作用。然而，目前關(guān)于白癜風(fēng)線粒體損傷的分子機(jī)制尚未闡明，深入研究線粒體氧化損傷修復(fù)的關(guān)鍵信號(hào)通路及靶點(diǎn)，對(duì)于保護(hù)黑素細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷以及防治白癜風(fēng)具有重要意義。
　　芳香烴受體（Aryl hydrocarbon receptor,AHR）是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控?cái)?shù)百種靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮多種重要的生物學(xué)功能。AHR能夠修復(fù)線粒體氧化損傷，減少線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但具體的分子

3、機(jī)制仍不清楚。近期研究報(bào)道，白癜風(fēng)患者皮損組織中AHR及下游靶基因表達(dá)顯著降低，提示白癜風(fēng)中AHR信號(hào)通路可能存在異常。因此，我們提出一新的研究假說(shuō)：AHR信號(hào)通路在保護(hù)線粒體功能對(duì)抗黑素細(xì)胞氧化損傷中具有重要作用；當(dāng)該通路異常時(shí)，細(xì)胞無(wú)法有效緩解線粒體氧化損傷，導(dǎo)致黑素細(xì)胞凋亡增加，誘發(fā)白癜風(fēng)發(fā)生。
　　目的：
　　1.分析AHR信號(hào)通路異常的遺傳背景機(jī)制及其在白癜風(fēng)發(fā)病中的作用。
　　2.明確AHR信號(hào)通路在保護(hù)線

4、粒體對(duì)抗黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1.通過(guò)分子流行病學(xué)研究及相關(guān)功能學(xué)研究，觀察AHR基因多態(tài)性與白癜風(fēng)罹患風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性及其分子機(jī)制。
　　2.應(yīng)用AHR配體處理正常人黑素細(xì)胞系PIG1，觀察AHR信號(hào)通路活化情況。
　　3.利用H2O2孵育PIG1細(xì)胞構(gòu)建氧化應(yīng)激模型，觀察氧化應(yīng)激條件下黑素細(xì)胞PIG1中AHR信號(hào)通路活化情況。
　　4.應(yīng)用AHR信號(hào)通路抑制劑CH223191或A

5、HR激活劑FICZ及H2O2共處理PIG1細(xì)胞，觀察氧化應(yīng)激條件下AHR信號(hào)通路對(duì)黑素細(xì)胞內(nèi)總ROS水平、細(xì)胞凋亡及生長(zhǎng)周期的影響。
　　5.應(yīng)用CH223191或FICZ及H2O2共處理PIG1細(xì)胞，觀察氧化應(yīng)激條件下AHR信號(hào)通路對(duì)黑素細(xì)胞線粒體內(nèi)膜ROS水平、線粒體膜電位、ATP合成水平、線粒體DNA水平以及線粒體損傷修復(fù)相關(guān)分子表達(dá)水平的影響。
　　6.觀察白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V及白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中AH

6、R表達(dá)情況及AHR信號(hào)通路激活情況。
　　結(jié)果及意義：
　　1.AHR基因遺傳多態(tài)性與白癜風(fēng)易感性密切相關(guān)；位于AHR啟動(dòng)子區(qū)的rs10249788位點(diǎn)能夠影響轉(zhuǎn)錄因子SP1與AHR啟動(dòng)子區(qū)的結(jié)合，進(jìn)而影響AHR基因轉(zhuǎn)錄活性；白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中AHR及SP1的mRNA表達(dá)水平均顯著下調(diào)，且rs10249788位點(diǎn)能夠影響個(gè)體AHR基因表達(dá)水平。
　　2.AHR激活劑可上調(diào)PIG1細(xì)胞中AHR信號(hào)通路下游靶基因

7、CYP1A1及CYP1B1的mRN A表達(dá)水平，提示正常人黑素細(xì)胞存在功能性AHR信號(hào)通路。
　　3.H2O2可促進(jìn)PIG1細(xì)胞中AHR發(fā)生核轉(zhuǎn)位，并能夠上調(diào)CYP1A1及CYP1B1的mRNA及蛋白表達(dá)水平；AHR信號(hào)通路特異性抑制劑CH223191能夠抑制上述作用；上述結(jié)果提示H2O2可促進(jìn)正常人黑素細(xì)胞中AH 信號(hào)通路激活。
　　4.氧化應(yīng)激條件下，抑制AHR信號(hào)通路后PIG1細(xì)胞生長(zhǎng)停滯、胞內(nèi)總ROS水平明顯升高、晚

8、期凋亡率顯著升高；上述結(jié)果提示氧化應(yīng)激條件下抑制AHR信號(hào)通路可加重黑素細(xì)胞氧化損傷。
　　5.氧化應(yīng)激條件下，抑制AHR信號(hào)通路后PIG1細(xì)胞線粒體ROS水平明顯升高、線粒體膜電位顯著降低、ATP合成水平顯著降低、線粒體DNA含量明顯減少；而進(jìn)一步激活A(yù)HR信號(hào)通路后PIG1細(xì)胞線粒體ATP合成水平及線粒體DNA水平均顯著升高；此外，調(diào)控AHR信號(hào)通路能夠影響線粒體生物合成調(diào)控分子Nfr1及其下游Tfam、CYCS的表達(dá)水平，而

9、對(duì)于細(xì)胞或線粒體自噬沒(méi)有明顯影響；上述結(jié)果提示氧化應(yīng)激條件下抑制AHR信號(hào)通路可加重線粒體氧化損傷，激活A(yù)HR信號(hào)通路能夠促進(jìn)線粒體生物合成過(guò)程。
　　6.白癜風(fēng)黑素細(xì)胞系PIG3V中AHR蛋白表達(dá)水平顯著降低，H2O2處理PIG3V細(xì)胞后CYP1A1蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，提示氧化應(yīng)激條件下白癜風(fēng)黑素細(xì)胞中AHR表達(dá)異常且存在激活障礙；白癜風(fēng)患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中AHR的mRN A表達(dá)水平顯著下調(diào)，且與疾病嚴(yán)重程度密切相關(guān)。

10、r>　　結(jié)論：
　　本研究首次明確AHR基因遺傳變異可影響AHR轉(zhuǎn)錄表達(dá)，與白癜風(fēng)易感性密切相關(guān)；在氧化應(yīng)激條件下，AHR表達(dá)異常可導(dǎo)致AHR信號(hào)通路激活障礙，影響下游線粒體生物合成及線粒體損傷修復(fù)過(guò)程，導(dǎo)致線粒體介導(dǎo)的黑素細(xì)胞凋亡增加，從而參與白癜風(fēng)黑素細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷過(guò)程。本研究意義在于：深入認(rèn)識(shí)AHR信號(hào)通路的生物學(xué)功能；初步闡述線粒體氧化損傷修復(fù)的新機(jī)制；明確AHR信號(hào)通路在保護(hù)黑素細(xì)胞對(duì)抗氧化應(yīng)激損傷中的重要作用，為指導(dǎo)