AAPH誘導小鼠早期胚胎氧化應激的分子機制及谷胱甘肽抗氧化作用的研究.pdf

1、近幾年隨著技術水平的不斷提高，體外受精技術被廣泛應用于優(yōu)良性狀家畜胚胎的規(guī)?；a、人類不孕不育的治療等方面。盡管研究者對于培養(yǎng)液的改良、培養(yǎng)條件的優(yōu)化做了大量的工作，由于不能完全模擬體內的受精環(huán)境，因此體外培養(yǎng)條件仍難達到與體內相當的胚胎發(fā)育率。研究表明，活性氧(reactive oxygen species，ROS)是影響胚胎體外發(fā)育的重要因素，但對于活性氧影響胚胎質量的分子機理仍知之甚少。本研究就活性氧誘導劑AAPH誘導小鼠早期胚

2、胎氧化應激的分子機制及抗氧化劑谷胱甘肽(Glutathione，GSH)的恢復作用進行了研究。
　　一、AAPH對小鼠早期胚胎的影響及其分子機制
　　1、采用濃度為0.1、1.0、1.5、2.0mM的AAPH分別處理受精卵和2-細胞胚胎。結果表明，1.5mM AAPH處理受精卵24h后，全部胚胎發(fā)生2-細胞阻滯，在48h后出現大量死亡的現象。處理2-細胞24h后，也全部停滯在2-細胞期。因此，本實驗選擇處理條件為1.5mM、

3、處理時間24h的受精卵作為研究對象。利用DCFH-DA熒光探針進行ROS檢測，同時利用實時熒光定量PCR檢測活性氧相關基因（Gpx4、Gpx6、Prdx2)的表達。結果顯示，處理組的活性氧水平顯著升高(P＜0.05)，并且Gpx6、Prdx2的表達量顯著高于對照組，而Gpx4的表達量顯著低于對照組(P＜0.05)。表明氧化應激模型構建成功。
　　2、JC-1染色、凋亡及其相關基因檢測結果顯示，處理組2-細胞胚胎的線粒體膜電位顯著降

4、低(P＜0.05)，凋亡相關基因（Bax、Caspase3、Caspase8、Caspase9）的表達均顯著升高(P＜0.05)，并檢測到早期凋亡信號。合子基因組激活相關基因（Zscan4d、eIF-1A、Hspa1b、H2afz）的表達量均極顯著降低(P＜0.01)。
　　二、GSH對AAPH處理后的早期胚胎發(fā)育的恢復及其作用機制
　　1、在1.5mM AAPH處理條件下，同時分別加入1、2、3mM的GSH分別處理受精卵和

5、2-細胞胚胎。處理受精卵24h后，各濃度的GSH均不能使2-細胞胚胎突破阻滯，但能夠顯著提高第一次卵裂率。其中，2mM GSH處理后第一次卵裂率最高。處理2-細胞24h后，胚胎有部分能夠突破2-細胞阻滯但均不能發(fā)育到囊胚階段。因此，本實驗選擇處理條件為2mM GSH+1.5mM AAPH、處理時間24h的受精卵作為研究對象。DCFH-DA染色及活性氧相關基因檢測結果顯示，與對照相比，活性氧水平仍顯著升高(P＜0.05)。
　　2、

6、加入GSH后，線粒體膜電位顯著升高(P＜0.05)，并且未檢測到早期凋亡信號以及合子基因組激活相關基因表達的恢復。
　　3、低濃度AAPH(0.5mM)處理受精卵后，只有8％的受精卵能發(fā)育到4-細胞，加入GSH后有23.7％能夠發(fā)育到4-細胞，顯著降低了胚胎的阻滯率(P＜0.05)，提高了胚胎的發(fā)育率，但胚胎仍不能發(fā)育到囊胚階段。
　　綜上所述，較高濃度的AAPH會引起活性氧水平的升高，從而產生氧化應激，進而引起線粒體膜電位