氧化應激誘導皮膚細胞凋亡的分子機制及褪黑素抗氧化干預的研究.pdf

1、目的：
　　1．了解在H2O2氧化應激的HaCaT細胞模型中，p38于細胞凋亡中的作用以及褪黑素抗氧化和抑制凋亡的效果。
　　2．探討大面積深Ⅱ度燙傷大鼠早期應用褪黑素對燙傷皮膚殘留毛囊細胞的保護作用。
　　3．研究大面積深Ⅱ度燙傷大鼠早期應用褪黑素對機體的抗氧化和抗炎作用。
　　方法：
　　1．HaCaT細胞分成4組，對照組、氧化組、抑制劑組、褪黑素組。除對照組外，其余3組均給予終濃度為730μmol的H

2、2O2刺激12h。抑制劑組在刺激前用p38抑制劑SB203580與細胞共培養(yǎng)1h；褪黑素組在刺激前用褪黑素與細胞共培養(yǎng)12h。
　　2.（1）在刺激后12h，檢測細胞懸液MDA，GSH含量；（2）MTT法檢測細胞活力；AO/EB(吖啶橙/溴化乙啶)和Hoechst33258熒光染色，caspase-3活性檢測，流式細胞分析儀檢測細胞凋亡情況。（3）首先用Western blot檢測730μmol/L的H2O2刺激HaCaT細胞0（

3、加入H2O2后即刻）、5、20、30、60、90min時p38蛋白含量，篩選出p38蛋白表達最強的時間點；然后在此時間點檢測各組細胞p38蛋白含量。
　　3．雄性SD大鼠48只，分為假燙組、燙傷組、褪黑素組，每組16只大鼠。燙傷組和褪黑素組大鼠在背部造成30％TBSA深Ⅱ度燙傷創(chuàng)面，燙傷組和褪黑素組于傷后1h補充平衡液抗休克治療。并且褪黑素組于傷后1min、8h、16h，以10mg/kg的劑量給予腹腔注射褪黑素溶液。
　　4

4、．每組其中6只于6、12、24h采集燙傷區(qū)域皮膚檢測丙二醛(MDA)和還原型谷胱甘肽(GSH)；利用原位缺口末端標記法（TUNEL）和半胱氨酸天門冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）免疫組織化學方法檢測燙傷皮膚組織殘留毛囊細胞凋亡情況。
　　5．每組其余10只大鼠于12h采集血清標本檢測MDA、GSH等反應自由基水平的指標；用ELISA方法檢測TNF-α和IL-1β等炎癥因子指標。于傷后12h采集燙傷皮膚組織，用TUNEL和cas

5、pase-3免疫組織化學檢測殘留毛囊細胞的凋亡情況。
　　結果：
　　1.（1）在刺激12h后，氧化組的氧化損傷明顯強于對照組；而褪黑素組氧化損傷輕于氧化組，但高于對照組。（2）在刺激12h后，MTT法顯示對照組、氧化組、抑制劑組和褪黑素組細胞生存率分別為(99.12±2.34)％、(80.56±4.65)％、(90.02±5.15)％、(89.10±4.22)％；AO/EB和Hoechst33258熒光染色方法均顯示氧化組

6、的細胞凋亡率明顯高于抑制劑組和褪黑素組。流式細胞儀檢測結果顯示對照組、氧化組、抑制劑組和褪黑素組細胞凋亡比例分別為(4.20±1.25)％、(30.01±8.94)％、(15.56±3.80)％、(12.66±4.22)％。（3）730μmol/L的H2O2刺激細胞5min，p-p38表達開始增加，在30min后達高峰，90min時仍明顯高于對照組。選擇30min作為刺激時間點，利用Westernblot方法發(fā)現(xiàn)抑制劑組和褪黑素組的p-

7、p38水平明顯低于氧化組。
　　2．與假燙組比較，燙傷組各時間點的皮膚組織MDA顯著升高，傷后12h達2.83±0.43nmol/mgprot高峰；GSH水平明顯下降，傷后12h水平最低為0.95±0.21mg/gprot（P<0.01）。在所有時間點，燙傷組細胞凋亡率都高于假燙組（P<0.01）。TUNEL顯示燙傷組傷后6h殘留毛囊凋亡細胞率增加到（20.2±3.4）％，在12h細胞凋亡率最高達到（31.2±3.6）％。與燙傷組

8、比較，褪黑素組MDA水平低于燙傷組，GSH水平高于燙傷組（P<0.05）；褪黑素組的殘留毛囊細胞凋亡率低于燙傷組，褪黑素組在傷后6h、12h的細胞凋亡率分別（10.9±3.2）％、（19.1±3.7）％（P<0.05）。caspase-3免疫組織化學顯示了相似的凋亡趨勢。
　　3．與假燙組比較,燙傷組傷后12h血清MDA顯著升高，GSH明顯下降；TNF-α，IL-1β含量顯著增加（P<0.01）。與燙傷組比較，褪黑素組12h血清M

9、DA含量降低了34％；GSH增加了37％；TNF-α下降了29％；IL-1β降低了35％（P<0.05）。TUNEL顯示燙傷組傷后12h殘留毛囊凋亡細胞率為（30.9±2.5）％，高于假燙組的（3.8±1.9）％（P<0.01）。而褪黑素組毛囊凋亡細胞率降低為（20.2±2.4）％，低于燙傷組（P<0.05）。caspase-3免疫組織化學顯示了相似的凋亡趨勢。
　　結論：
　　1．在H2O2氧化應激HaCaT細胞模型中p3