TIP30感受細胞氧化應(yīng)激誘導(dǎo)p53依賴的細胞凋亡機制研究.pdf

1、研究目的:肝臟是人體的主要的解毒器官,代謝十分活躍,肝癌細胞的代謝不僅更為旺盛,而且代謝途徑和方式亦有著明顯變化。細胞代謝產(chǎn)生的副產(chǎn)物,如活性氧分子簇(ROS)在細胞的許多死亡途徑中充當(dāng)?shù)诙攀沟淖饔?維持了正常細胞的衰老、死亡過程。腫瘤細胞能夠逃避這些死亡途徑,其抑癌基因的表達失調(diào)是重要原因之一。 TIP30,又稱CC3或HTIP2,是一個抑癌基因的蛋白產(chǎn)物,能夠促進細胞凋亡,在抑制肝癌發(fā)生和發(fā)展過程中起著重要的作用。晶體結(jié)構(gòu)

2、的分析中TIP30的同源二聚體沿著中心對稱軸出現(xiàn),接觸面存在一個由第172位的半胱氨酸形成的二硫鍵和一個PEG600分子。因為二硫鍵的變化對于細胞感受自身活性氧的水平的變化和信號傳遞起到關(guān)鍵作用,在氧化應(yīng)激的條件下TIP30可能被氧化形成分子間二硫鍵,執(zhí)行其抗腫瘤的功能。 基因表達轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)的重要性逐漸的被人們所重視。處于信使RNA的3'非翻譯區(qū)的富含腺嘌呤脲嘧啶元件(ARE)有著調(diào)節(jié)信使RNA降解的功能。RNA結(jié)合蛋白HuR通

3、過和ARE反式結(jié)合,提高信使RNA穩(wěn)定性或者上調(diào)信使RNA穩(wěn)定性的翻譯水平,從而上調(diào)基因表達水平。HuR在細胞受到各種刺激時從細胞核向細胞漿中分布轉(zhuǎn)移,發(fā)揮對靶向結(jié)合的轉(zhuǎn)錄物提高穩(wěn)定性作用。細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體β2(Importin β2)參與了HuR向細胞核內(nèi)的轉(zhuǎn)運。最近發(fā)現(xiàn)TIP30能夠和多種細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體β家族成員結(jié)合,抑制核內(nèi)轉(zhuǎn)運并引起細胞凋亡。因此,TIP30可能通過與細胞核質(zhì)轉(zhuǎn)運受體β結(jié)合的方式調(diào)控HuR在細胞內(nèi)的分布。

4、 先前發(fā)現(xiàn)TIP30能夠通過提高p53的表達水平而誘導(dǎo)細胞凋亡,而提高p53表達水平的方式并不是通過穩(wěn)定p53蛋白實現(xiàn)的。在本研究中發(fā)現(xiàn)在氧化應(yīng)激條件下TIP30能夠以形成二硫鍵的方式被氧化,導(dǎo)致HuR在細胞漿內(nèi)的積累和p53信使RNA的穩(wěn)定,最終誘導(dǎo)線粒體介導(dǎo)的凋亡。 研究方法: ①利用熒光染料2',7'-二氯熒光素二乙酸酯(DCF-DA)檢測細胞內(nèi)活性氧強度。 ②Hoecest 33342染色法檢測細胞凋亡

5、。四甲基諾丹明乙酯(TEME)染色法檢測細胞凋亡過程中線粒體膜電勢的去極化現(xiàn)象。 ③非還原性PAGE電泳和Western blotting蛋白印跡檢測蛋白分子分子構(gòu)象的變化。熒光共振能量傳遞實驗檢測活體細胞中蛋白二聚體的形成。 ④Real-time PCR檢測基因的信使RNA的表達水平。 ⑤細胞核與細胞漿的分離。 ⑥RNA干擾下調(diào)細胞內(nèi)基因信使RNA的表達。 ⑦通過免疫共沉淀檢測蛋白相互作用,蛋白

6、因子與信使RNA的結(jié)合。 實驗結(jié)果: ①感染Ad-TIP30對細胞內(nèi)活性氧含量高的肝癌HepG2細胞引起細胞死亡,細胞內(nèi)活性氧含量低的正常肝細胞則幾乎不受影響。 ②非還原膠電泳和熒光共振能量傳遞實驗中顯示了氧化應(yīng)激條件下TIP30蛋白二聚體的形成。 ③外源性表達TIP30在氧化應(yīng)激條件下使得p53信使RNA表達水平上調(diào)并增強其轉(zhuǎn)錄活性。 ④外源性表達TIP30后引起細胞線粒體膜極性的降低和細胞凋亡

7、,p53缺失或者RNA干擾后表達下調(diào)的肝癌細胞系細胞中沒有發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象。 ⑤在氧化應(yīng)激條件下外源性表達TIP30后p53信使RNA降解的半衰期顯著延長。免疫共沉淀分析中,在外源性TIP30表達的情況下,信使RNA穩(wěn)定蛋白HuR與p53信使RNA的結(jié)合量。 ⑥TIP30在氧化應(yīng)激的條件下通過和核轉(zhuǎn)運蛋白Importinβ結(jié)合誘導(dǎo)HuR在細胞漿內(nèi)的積累。 研究結(jié)論:結(jié)果顯示TIP30通過提高p53信使RNA的穩(wěn)定性的方