人類抑癌蛋白p53誘導(dǎo)酵母細(xì)胞凋亡的研究.pdf

1、目的：
　　在酵母細(xì)胞中異體表達(dá)人類抑癌蛋白p53并探討利用酵母檢測(cè)p53功能的可能性。
　　方法：
　　以乳腺癌細(xì)胞株MCF-7（含野生型p53）的RNA逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增野生型p53基因并克隆于受半乳糖誘導(dǎo)的酵母表達(dá)質(zhì)粒pRS426Gal1/10中，使用定點(diǎn)突變構(gòu)建突變型p53（R248W、G245S、R273H和R249S）,經(jīng)測(cè)序確認(rèn)后質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞，觀察p53誘導(dǎo)表達(dá)后酵母細(xì)胞的凋亡和

2、生長(zhǎng)狀況。利用蛋白印跡（Western blot）檢測(cè)不同誘導(dǎo)時(shí)間p53的表達(dá)，應(yīng)用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測(cè)DNA斷裂、Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸外翻指示細(xì)胞凋亡。
　　結(jié)果：
　　野生型p53誘導(dǎo)3小時(shí)后酵母菌即出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制，誘導(dǎo)9小時(shí)后可檢測(cè)到p53表達(dá)，并隨時(shí)間延長(zhǎng)表達(dá)增加，生長(zhǎng)抑制更甚，酵母細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡表型。而表達(dá)突變型p53（R248W、G245S、R273H和R249